sebagai satu-satunya sumber karbon, enzim diekspresikan, sedangkan ketika cendawan ditumbuhkan pada media yang mengandung glukosa, tidak ada ekspresi
selulosa. Hal ini menandakan bahwa ekspresi enzim selulase diinduksi oleh selulosa dan dihambat oleh glukosa. Selain selulosa, beberapa molekul lain
seperti, laktosa, saporosa, selobiosa, dan selotriosa diketahui dapat menginduksi ekspresi selulase Kubicek et al. 1993.
III.
BAHAN DAN METODE
3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium BIORIN Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi Institut Pertanian Bogor dari bulan Agustus
2007 - Desember 2008.
3.2 Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan adalah beberapa isolat A. niger dan Trichoderma koleksi Bagian Mikologi Departemen Biologi F.MIPA dan Pusat Penelitian
Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi, primer spesifik EAF 5’-CTCTAACGCC CAACATGAAG-‘3 dan EAR 5’-TCTAGAACCCTAGTTGACACTGG-‘3
untuk amplifikasi gen endoglukanase yang didesain menggunakan program Primer3 versi 0.4.0
http:frodo.wi.mit.eduprimer3input.htm berdasarkan gen
endoglukanase A Aspergillus niger dari GenBank dengan nomor aksesi AJ225451 posisi primer EAF= basa ke-14 sebelum kodon awal sampai basa ke-3 setelah
kodon awal, primer EAR= basa ke-9 sebelum kodon akhir sampai basa ke-11 setelah kodon akhir dengan produk yang diharapkan sebesar 743 bp, primer ActF
5’-ATGGCAGATGCCGAGGATAT-‘3 dan ActR2 5’-TCGAGGTCGGCCAA CAATAC-‘3 untuk amplifikasi gen aktin posisi primer ActF = 20 basa pertama
dari ekson 1, primer ActR2 = basa ke 44 – basa ke 63 dari ekson 2 dengan produk yang diharapkan sebesar 123 bp, pGEM-T Easy sebagai vektor pengklonan dan E.
coli galur DH5α sebagai inang vektor rekombinan.
3.3 Metode
Penelitian dilakukan dalam dua tahap Gambar 5. Tahap pertama ialah seleksi aktivitas enzim endoglukanase dari beberapa isolat A. niger dan
Trichoderma dan dilanjutkan dengan tahap kedua, yaitu melakukan isolasi gen
penyandi enzim endoglukanase terhadap isolat potensial terpilih.
3.3.1 Pemeliharaan biakan cendawan
Isolat-isolat Aspergillus niger dan Trichoderma dipelihara dalam media agar CMC carboxymethyl cellulose dan diinkubasikan pada suhu ruang selama 7
hari yang selanjutnya digunakan sebagai sumber inokulum.
Gambar 5 Skema urutan tahapan penelitian
3.3.2 Uji aktivitas selulolitik 3.3.2.1 Uji aktivitas selulolitik secara kualitatif
Uji kualitatif aktivitas enzim endoglukanase dilakukan sesuai dengan metode Onsori et al. 2004 yang dimodifikasi dengan mengukur zona bening
yang terbentuk pada media agar CMC CMC 1 bv, ekstrak yeast 0.05 bv, MgSO
4
0.05 bv, NaNO
3
0.2 bv dan KH
2
PO
4
0.1 bv, KCl 0.05 bv, agar 1.5 bv. Sebagai standar digunakan isolat Trichoderma reesei yang
merupakan standar aktivitas enzim selulase. Secara garis besar metode yang digunakan adalah sebagai berikut. Koloni dengan diameter sepuluh mm dari
masing-masing isolat hasil peremajaan diinokulasikan ke dalam media agar CMC. Kultur kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama satu hari. Untuk mengetahui
aktivitas selulolitik cendawan, biakan berumur 1 hari diwarnai dengan pewarna
Koleksi isolat TAHAP I
Skrining enzim endoglukanase TAHAP II
Isolasi gen penyandi enzim endoglukanase
Isolat potensial terpilih
Uji kualitatif aktivitas enzim endoglukanase
Uji kuantitatif aktivitas enzim endoglukanase
Desain primer
Isolasi gen penyandi enzim endoglukanase
Sekuensing dan karakterisasi DNA
