Verifikasi pengklonan gen eglA

dari Aspergillus terreus E-value 6.9e-113 dan 75 dengan endoglukanase atau cel A dari Aspergillus oryzae E-value 4.8e-105 Lampiran 5 dan 6. BLAST merupakan program pencari similaritas suatu urutan nukleotida atau asam amino dengan database yang berbasis local alignment, yaitu penyejajaran pada suatu segmen sekuen yang lebih pendek dengan derajat similaritas yang sangat tinggi. Similaritas mengindikasikan homologi suatu gen atau protein. Jika kedua urutan gen atau protein homolog maka dapat dikatakan bahwa keduanya mempunyai leluhur, fungsi dan struktur yang sama. Dua gen atau fragmen DNA dikatakan homolog jika 70 urutan nukleotidanya atau 25 urutan asam aminonya identik panjang urutan minimal 100 Claviere Notredame 2003. Berdasarkan hal diatas maka dapat dipastikan bahwa eglA merupakan gen egl A dari Aspergillus niger. Gambar 14 Peta situs pemotongan eglA dengan menggunakan program NEBcutter

4.3.3 Analisis situs pemotongan gen eglA

Analisis situs pemotongan enzim restriksi endoglukanase digunakan untuk membuat peta situs pemotongan enzim restriksi peta restriksi pada suatu gen atau fragmen DNA. Peta restriksi ini bermanfaat dalam menentukan enzim-enzim restriksi apa saja yang dapat digunakan dalam kegiatan manipulasi suatu gen atau fragmen DNA. Pada analisis peta pemotongan gen eglA terlihat tidak terdapat situs pemotongan EcoRI yang digunakan untuk mengeluarkan DNA sisipan dari plasmid pGEM-T Easy sebagai vektornya Gambar 14. Hasil ini sekaligus dapat digunakan untuk verifikasi keberhasilan pengklonan gen eglA pada plasmid pGEM-T Easy. Selain itu terdapat beberapa situs pemotongan yang terdapat pada gen eglA dan situs pengklonan MCS pGEM-T Easy, seperti ApaI, NcoI, PstI dan NsiI, sehingga enzim-enzim ini tidak dapat digunakan untuk mengeluarkan DNA sisipan dari plasmid, karena akan memotong DNA sisipan juga Gambar 14. Gambar 15 Perbandingan domain EglA dari berbagai organisme berdasarkan database pfam

4.3.4 Analisis domain EglA

Analisis domain EglA dilakukan menggunakan program Pfscan berdasarkan database Pfam. EglA memiliki katalitik domain yang termasuk dalam A. niger Glyco hydro 12: 82-239 T. reesei Glyco hydro 12: 81-234 S. lividans Glyco hydro 12: 111-261; CBM 2 : 279-378 B. licheniformis Glyco hydro 12: 104-261 kelompok Glikosida hidrolase famili 12 GH12 pada posisi asam amino ke-82 sampai asam amino ke-239 Gambar 15. Arsitektur EglA A. niger ini sama dengan arsitektur beberapa anggota famili GH12 lainnya, seperti Cel12A T. reesei dan Cel12A B. Licheniformis. Arsitektur jenis ini hanya mengandung katalitik domain dan tidak mengandung carbohydrate binding moduls CBM. Secara umum, kelompok glikosida hidrolase terdiri dari dua domain utama, yaitu katalitik domain dan carbohydrate binding moduls CBM yang dihubungkan oleh suatu linker yang kaya akan prolin Gambar 16. Posisi domain katalitik maupun domain CBM dapat terdapat pada C-terminal maupun N- terminal. Posisi ini tidak menentukan spesifisitas suatu enzim Gilkes et al. 1991. Peran domain CBM pada enzim sampai saat ini masih belum jelas. Namun demikian Hashimoto 2006 menyatakan peran utama CBM meningkatkan efisiensi fungsi katalisis enzim-enzim karbohidrase walaupun dengan mekanisme yang belum jelas. linker Gambar 16 Domain umum selulase yang terdiri dari domain katalitik dan CBM yang dihubungkan oleh daerah penghubung linker GH12 merupakan salah satu famili glikosida hidrolase yang mempunyai aktivitas endoglukanase dan xyloglukan hidrolase. Mekanisme katalisisnya adalah retaining dengan Glutamat Glu sebagai basa nukleofil maupun donor protonnya. Sampai saat ini GH12 mempunyai sekitar 151 anggota dengan 7 arsitektur yang berbeda. Sebagian besar anggota mempunyai arsitektur tanpa domain CBM. Sementara itu arsitektur dengan kombinasi antara katalitik domain dan domain CBM, seperti pada Cel2B S. lividans hanya sedikit. Berdasarkan perbandingan struktur homolog dengan struktur endoglukanase lain yang sudah diketahui, residu-residu yang berperan dalam fungsi katalitik EglA A.niger IPB1 maupun pengikatan substratnya dapat dideduksikan Gambar 17. Glu116 diprediksi berperan sebagai nukleofil dan Glu204 diprediksi berperan sebagai donor proton. Pada famili GH12, posisi Catalytic domain CBM