6. Gelas Erlenmeyer
Pyrex 7.
Oven Memmert
8. Autoklaf
Webeco 9.
Inkubator Gallenkamp
10. Mikroskop
Prior England 11.
Neraca Analitis Mettler Toledo
12. Shaker
Eberbach 13.
Jarum Ose 14.
Spatula 15.
Pipet tetes 16.
Magnetic stirrer 17.
Aluminium Foil
3.3. Prosedur Penelitian
3.3.1. Pembuatan YEMA Yeast Extract Manitol Agar
Ditimbang 0,2 gram Yeast Extract, 2 gram Manitol, 0,1 gram K
2
HPO
4
, 0,04 gram MgSO
4
, 0,1 gram NaCl, dan 7,8 gram PDA. Kemudian dimasukkan ke dalam gelas beaker. Lalu ditambahkan 200 mL akuades, kemudian diaduk hingga rata. Lalu
dipanaskan sampai mendidih. Ditambah 0,25 gram congo red yang diencerkan dengan 100 mL akuades, lalu ditambahkan ke dalam media YEMA yang telah homogen
hingga berwarna merah. Dibagi ke dalam 20 tabung reaksi. Diautoklaf pada tekanan 15 psi dengan suhu 121
o
C selama 1 jam.
3.3.2. Pembuatan YMB Yeast Manitol Broth
Ditimbang 0,1 gram Yeast Extract, 1 gram Manitol, 0,05 gram K
2
HPO
4
, 0,02 gram MgSO
4
dan 0,01 gram NaCl. Kemudian dimasukkan ke dalam gelas beaker. Lalu ditambahkan 100 mL akuades, kemudian diaduk hingga rata. Lalu dipanaskan sampai
mendidih. Diautoklaf pada tekanan 15 psi dengan suhu 121
o
C selama 1 jam.
Universitas Sumatera Utara
3.3.3. Preparasi Sampel
Sampel yang digunakan adalah Rhizobium hasil isolasi dari bintil akar putri malu
Lampiran A gambar 1, yang diambil dari FMIPA USU. Pengambilan sampel
dilakukan dengan mencabut putri malu yang akarnya berbintil lalu bintilnya
dikumpulkan. Kemudian dibawa ke Laboratorium Biokimia FMIPA USU.
3.3.4. Isolasi Bakteri Rhizobium dari Bintil Akar
Sampel yang telah dibawa ke Laboratorium, kemudian diproses. Bintil akar dipilih dari tanaman putri malu yang tersedia kemudian bintil akar tersebut dicuci dengan
merendamnya ke dalam tabung reaksi yang berisi akuades kemudian disaring. Lalu bintil akar tersebut dimasukkan dalam tabung reaksi. Dilanjutkan dengan disemprot
dengan menggunakan alkohol 70. Lalu disemprot kembali dengan larutan klorok dan dibilas dengan akuades. Kemudian bintil akar yang telah steril digerus
menggunakan gelas objek sambil ditambahkan akuades. Lalu bintil akar yang steril tersebut digiling.
3.3.4.1. Isolasi Bakteri Rhizobium pada Media Selektif dengan Penambahan Congo Red
Satu ose dari suspense bintil akar putri malu yang sudah disiapkan sebelumnya
diambil, kemudian digoreskan pada media YEMA + Congo Red Lampiran A, gambar 2. Lalu kultur diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 2 hari. Pertumbuhan Rhizobium diamati dengan memperhatikan bentuk dan warnanya. Pada umumnya
koloni berwarna putih transparan, mukoid dan sedikit berlendir. Rhizobium yang diperoleh disimpan dalam lemari es pada suhu 4
o
C. Bakteri yang diperoleh
ditumbuhkan kembali pada medium YEMA Lampiran A gambar 3 dengan
menggunakan metode gores sinambung, lalu diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 2 hari. Tujuannya yaitu untuk memperoleh biakan murni dari bakteri Rhizobium.
Universitas Sumatera Utara
3.3.4.2. Identifikasi Bakteri Rhizobium
Plat kaca atau gelas objek disterilkan dengan alkohol 70. Satu ose biakan media
diambil Lampiran A gambar 4. Kemudian diletakkan di atas plat kaca ditetesi
akuades sebanyak 2 tetes lalu didiamkan sampai kering. Plat kaca kemudian ditetesi dengan larutan kristal violet dan didiamkan selama 30 detik, lalu dicuci dengan
akuades. Plat kaca ditetesi kembali dengan larutan iodine dan didiamkan selama 30 detik, lalu dicuci dengan akuades. Kemudian ditetesi dengan larutan aseton alkohol
dan didiamkan selama 30 detik, dicuci dengan akuades. Plat kaca ditetesi kembali dengan larutan safranin dan didiamkan selama 30 detik, dan dicuci dengan akuades,
dibiarkan mengering lalu diamati dibawah mikroskop.
3.3.5. Pembuatan Starter Kultur
Biakan Rhizobium yang ditumbuhkan kembali pada YEMA kemudian diambil 1-2 ose dan dicampur dengan 100 mL Yeast Manitol Broth YMB dalam gelas Erlenmeyer
Lampiran A gambar 5, lalu dikocok dengan menggunakan shaker pada temperatur
kamar hingga diperoleh starter kultur.
3.3.6. Pencampuran Starter dengan Medium Pembawa Carrier
Dolomit sebagai medium pembawa ditimbang sebanyak 140 gram lalu disterilkan. Sterilisasi dilakukan pada suhu 121
o
C pada tekanan 15 psi selama 60 menit. Medium yang sudah disterilisasi dibagi wadah plastik dengan pembagian sebagai berikut :
1. Wadah I : 5 g dolomit ditambahkan dengan 35 mL Starter 1:7
2. Wadah II : 5 g dolomit ditambahkan dengan 40 mL Starter 1:8
3. Wadah III : 5 g dolomit ditambahkan dengan 45 mL Starter 1:9
4. Wadah IV : 5 g dolomit ditambahkan dengan 50 mL Starter 1:10
Masing-masing wadah kemudian dibolak balik sehingga antara starter dengan media tercampur secara homogen lalu diinokulasikan dan disimpan selama 5 minggu pada
temperature di bawah 20
o
C Lampiran A gambar 6.
Universitas Sumatera Utara
3.3.7. Pengujian Jumlah Sel dari Medium Pembawa Carrier
