musim, serta kelembaban terhadap tanaman induk sangat mempengaruhi perkembangan eksplan. Tanaman induk dituntut untuk berkecukupan zat
hara, lama penyinaran, intensitas cahaya serta hormon tumbuh. Dengan kata lain, pertumbuhannya harus optimum Katuuk, 1989.
Kemampuan bagian tanaman dalam pengulturan juga dipengaruhi oleh jenis tanaman. Secara umum tanaman berkayu lebih sulit untuk
ditumbuhkankan dibanding herbaseus, monokotil lebih mudah dari dikotil. Kesulitan membentuk kalus tidak hanya berdasarkan hal-hal tersebut, tetapi
lebih berdasar pada aspek fisiologi dan biokimia bahan tanam Santoso dan Nursandi, 2002.
d.Genotip eksplan. Genotip adalah faktor endogen yang paling utama mempengaruhi
perkembangan jaringan eksplan, dibandingkan faktor-faktor lain. Perbedaan kemampuan untuk beregenerasi disebabkan oleh genotip jelas dapat dilihat
pada tanaman monokotil, dikotil dan gymnospermae. Dari ketiga kelompok ini, kemampuan untuk beregenerasi yang paling rendah adalah tanaman
gymnospermae, kemudian diikuti oleh tanaman monokotil, dan terakhir oleh tanaman dikotil. Selanjutnya dikatakan bahwa apabila satu jenis tanaman
dengan mudah beregenerasi in vivo maka sifat ini berlaku juga pada in vitro Katuuk, 1989.
4. Kalus
Jika suatu eksplan ditanam pada medium padat atau dalam medium cair yang sesuai, dalam waktu 2 – 4 minggu, tergantung spesiesnya akan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
terbentuk massa kalus Yuwono, 2006. Kalus adalah jaringan yang tak berbentuk dan tak terorganisasi. Jaringan ini merupakan hasil pembelahan sel
yang berpotensi tinggi untuk terus-menerus membelah diri. Kalus adalah satu fase yang harus dilalui selama pengulturan organ, jaringan, maupun
pengulturan sel-sel yang mendahului Katuuk, 1989. Wetherell 1982 mendefinisikan kalus sebagai pertumbuhan sel yang belum berdiferensiasi,
membentuk tumor sebagai akibat dari pengaruh auksin dan sitokinin yang tinggi.
Secara alami, tanaman juga dapat membentuk kalus sebagai upaya perlindungan tanaman karena tanaman mengalami perlukaan infeksi bakteri,
gigitan serangga atau nematoda dan juga karena tanaman mengalami stress Santoso dan Nursandi, 2002. Dalam kultur jaringan, kalus terbentuk karena
lukairisan pada eksplan sebagai respon terhadap hormon baik eksogenus maupun endogenus. Adanya rangsangan ini menyebabkan sel berubah dari
bentuk inaktif menjadi aktif Katuuk, 1989. Sel-sel penyusun kalus adalah sel-sel parenkim yang mempunyai
ikatan yang renggang dengan sel-sel lainnya Santoso dan Nursandi, 2002. Pembelahan sel tidak terjadi pada seluruh permukaan eksplan, tetapi hanya
pada bagian meristematik, yaitu lapisan yang terletak pada bagian luar sel perifer. Lapisan bagian dalam merupakan jaringan yang sudah tua dan tidak
membelah lagi. Setelah pembelahan sel bagian luar berkurang, kalus akan terlihat membulat atau kompak, dan selanjutnya akan berlangsung proses
organoganesis atau embriogenesis Katuuk, 1989.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5. Sterilisasi
Menciptakan dan memelihara kondisi aseptik merupakan pekerjaan yang paling berat dalam kultur jaringan. Spora dari bakteri dan jamur yang ada
di sekitar kita dapat jatuh atau terbawa sampai pada eksplan karena adanya pergerakan udara. Akhirnya spora dan jamur akan tumbuh dan berkembang,
dan dalam beberapa hari akan tumbuh menjadi koloni mikrobial sehingga objek kultur dikatakan terkontaminasi Katuuk, 1989.
Media kultur jaringan merupakan sumber makanan yang baik untuk bakteri dan fungi, dan semua prosedur in vitro harus memuat pencegahan
terhadap kontaminasi mikroba Wetherell, 1982. Ada beberapa teknik sterilisasi yang biasa digunakan dalam kultur jaringan tanaman, yaitu:
a. Sterilisasi panas basah
Cara sterilisasi panas basah adalah dengan menggunakan uap air. Alat yang digunakan untuk sterilisasi ini adalah autoklaf. Hampir semua
mikroba akan mati setelah diberi uap air dengan suhu 121 ˚C selama 10-15
menit. Cara sterilisasi ini dapat digunakan untuk mensterilkan media kultur, air, alatinstrumen, peralatan gelas serta peralatan plastik yang
tahan akan suhu panas. Lama sterilisasi ada aturannya, untuk mensterilkan media 20-75 ml dibutuhkan waktu 15-20 menit, media 75-500 ml
dibutuhkan waktu 20-25 menit, media 500-5000 ml dibutuhkan waktu 25- 35 menit, yang semuanya dilakukan pada suhu 121
˚C; sedangkan untuk mensterilkan peralatan gelas dibutuhkan waktu 30 menit dengan suhu
130 ˚C Katuuk, 1989.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
b. Sterilisasi panas kering
Cara sterilisasi panas kering adalah dengan menggunakan suhu tinggi dan dalam kondisi kering. Alat yang digunakan untuk sterilisasi ini adalah
oven. Oven digunakan untuk mensterilkan alat-alat yang tidak mudah terbakar, antara lain: alat-alat gelas dan alat-alat dari logam. Namun dalam
keadaan tertentu dimana suhu tidak terlalu panas, alat dapat dibungkus dengan kertas kemudian disterilkan. Namun bukan berarti semua alat dari
bahan logam harus disterilkan dengan cara ini. Alat-alat seperti pisau serta scalpel tidak dapat disterilkan dengan cara ini sebab dapat merusak
ketajaman pisau alat Katuuk, 1989. Lama pemanasan tergantung pada suhu. Biasanya sterilisasi untuk
suhu 160 ˚C, memerlukan waktu 45 menit; 170˚C selama 18 menit; 180˚C
selama 7,5 menit, dan 190 ˚C selama 1,5 menit. Suhu harus terus dikontrol,
sebab pada suhu 170 ˚C, kertas mulai hancur. Setelah selesai proses
sterilisasi, alatinstrumen dikeluarkan dan dibawa ke ruang transfer, dan dapat disterilkan lagi dengan menggunakan sinar ultraviolet Katuuk,
1989. c.
Sterilisasi dengan memakai nyala Alatinstrumen yang sudah disterilkan dengan oven, dikeluarkan dari
bungkusnya, dicelupkan dalam etanol 70 dan dilewatkan pada nyala lampu spiritus. Setiap beberapa saat instrument harus dicelupkan ke dalam
etanol kemudian dibakar. Perlakuan ini berjalan terus selama kegiatan inokulasi yang berlangsung di dalam kotak transfer LAF Katuuk,1989.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
d. Sterilisasi dengan bahan kimia
Sterilisasi dengan bahan kimia merupakan pembasmian mikroba dengan memakai bahan kimia. Biasanya bahan kimia dipakai untuk
mensterilkan permukaan saja, yang meliputi material tanaman dapat disterilkan dengan menggunakan natrium hipoklorit, perak nitrat atau air
brom; sedangkan instrumen, tangan pekerja, serta ruang atau kotak transfer dapat disterilkan dengan menggunakan alkohol 70 Katuuk, 1989.
Banyak jenis bahan pencuci yang bisa digunakan untuk sterilisasi material tanaman. Jenis dan lama sterilisasi tergantung pada kepekaan
material tanaman. Terlalu lamanya proses sterilisasi dengan konsentrasi bahan pencuci yang tinggi, akan mematikan mikroba sekaligus merusak
jaringan tanaman yang disterilkan. Di samping itu, bahan pencuci hendaknya bersifat lebih mudah larut. Bila tidak demikian, sisa zat pencuci
ini akan tetap pada material tanaman, yang dapat mengganggu pertumbuhan eksplan Katuuk, 1989.
e. Sterilisasi dengan cahaya
Ruang dan kotak transfer sulit disterilkan hanya dengan menggosok dengan alkohol atau bahan kimia pada permukaan. Untuk itu digunakan
lampu germisidal dengan sinar ultraviolet. Ada laboratorium yang sudah memasangnya di langit-langit atau pada tempat lain dengan tujuan semua
bagian terkena cahaya. Kelemahan menggunakan sinar ultraviolet adalah pada tempat-tempat yang tidak terkena cahaya, proses sterilisasi tidak
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
terjadi. Selain itu, sinar ultraviolet hanya mampu mematikan bentuk fertilisasi bakteri dan jamur, bukan bentuk spora Katuuk, 1989.
6. Penanaman eksplan
