subkultur ini dilakukan sebagai berikut, semua perlengkapan yang digunakan yaitu pinset, skapel, bunsen, alat-alat gelas, botol berisi alkohol 70 dan
botol-botol yang berisi media yang telah diketahui beratnya dimasukkan kedalam laminar air flow dan disterilkan selama ± 1 jam dengan lampu UV.
Media yang berisi kalus kemudian disemprot dengan alkohol 70 kemudian dimasukkan ke dalam laminar air flow. Ketika botol akan dibuka
dan ditutup, maka dilakukan proses flambir. Kemudian ambil kalus dengan pinset dan letakkan di atas cawan petri. Bersihkan kalus dari sisa-sisa eksplan
hingga bersih kemudian belah bagian kalus tersebut dan potong-potong dengan menggunakan pertolongan skapel dan pinset dengan ukuran kalus
awal, yaitu 3–5 mm lalu ditanam dalam media yang baru secara aseptis. Kalus yang telah ditanam tadi kemudian diinkubasikan di dalam ruang inkubator
dengan suhu ruangan 18 ˚C serta disinari dengan lampu TL “Day Light” 20
watt dengan ketinggian 40 cm. Sub-kultur ini dibuat sebanyak 27 botol. Untuk mengetahui bobot kalus maka dilakukan penimbangan pada media baru yang
berisi kalus, selanjutnya bobot yang diperoleh dikurangkan dengan bobot media awal sebelum ditanami kalus.
8. Pemanenan
Setelah dilakukan subkultur, tiap 4 hari sekali dilakukan pemanenan sebanyak 3 buah botol yang berisi kalus lalu dibersihkan dari sisa-sisa agar
yang masih melekat. Setelah kalus bersih kemudian dilakukan penimbangan dan akan mendapatkan bobot kalus basah. Kalus yang telah dipanen kemudian
dikeringkan pada suhu 40-50 ˚C hingga didapatkan perbedaan bobot sebesar
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
0,5 mg bobot zat dari 2 penimbangan berurutan berselang 1 jam atau dengan kata lain setelah didapatkan berat kalus kering yang konstan. Catat bobot
kering kalus hasil setiap pemanenan. Kalus kering yang diperoleh kemudian digerus dengan menggunakan mortir dan stamper . Selanjutnya serbuk kalus
yang diperoleh, disimpan di dalam flakon dan dikumpulkan sebanyak 2 gram untuk dibuat ekstrak sehingga dapat diketahui metabolit sekunder dalam kalus.
9. Analisis pertumbuhan kalus
Analisis pertumbuhan kalus dalam penelitian ini menggunakan analisis menggunakan grafik pola pertumbuhan kalus berdasarkan data biomassanya.
Kalus basah yang diperoleh dari setiap pemanenan dikeringkan hingga bobotnya konstan dan ditimbang. Pertumbuhan kalus dihitung berdasarkan
persentase pertambahan bobot biomassa kalus. Kemudian dibuatkan grafik pola pertumbuhan kalus, dengan menghubungkan antara pertambahan bobot
kalus kering dan umur kalus.
10. Pengeringan dan pembuatan serbuk daun kamboja jepang
Daun kamboja jepang dikeringkan di dalam oven pada suhu 40-50
˚
C. Kemudian daun yang telah dikeringkan tersebut, digerus dengan
menggunakan mortir dan stamper. Serbuk daun yang diperoleh, disimpan di dalam flakon.
11. Uji tabung
Sepuluh gram serbuk dimaserasi selama 1 jam dengan penyari alkohol 70. Larutan disaring, dan filtrat yang diperoleh ditambah larutan Pb-asetat
pekat hingga terjadi pengendapan sempurna. Endapan yang terjadi dipisahkan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
dengan sentrifugasi. Supernatan yang diperoleh ditambah larutan natrium sulfat 6,3 untuk menghilangkan sisa-sisa Pb. Bila terjadi endapan, endapan
dipisahkan dengan sentrifugasi lalu supernatan diambil. Supernatan kemudian disari dengan 10 ml kloroform sebanyak 3 kali. Sari kloroform dipekatkan
hingga kira-kira 5 ml. a.
uji Baljet Sari kloroform diambil secukupnya lalu diencerkan dengan metanol 3-5
kali lipat volume asalnya dan ditambahkan pereaksi Baljet. Perubahan warna larutan menjadi jingga menunjukkan adanya glikosida dengan
aglikon kardenolida. b.
uji Raymond Sari kloroform diambil secukupnya lalu diencerkan dengan metanol 3-5
kali lipat volume asalnya dan ditambahkan pereaksi Raymond. Perubahan warna larutan menjadi ungu menunjukkan adanya glikosida dengan aglikon
kardenolida Dwiatmaka dan Wulandari, 2005.
12. Pembuatan ekstrak kalus daun kamboja jepang
