54 suhu 50
C dan kemudian dihilangkan sisa pelarutnya dengan gas nitrogen, selanjutnya ekstrak siap digunakan untuk analisis.
2. Pengujian Kebocoran metabolit seluler Chia et al 2000
Analisis kebocoran sel dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer dan pengukuran absorbansi dilakukan pada panjang gelombang 260 nm untuk
kandungan nitrogen dari asam nukleat dan panjang gelombang 280 nm untuk menentukan kandungan nitrogen dari protein.
Suspensi ke enam jenis bakteri uji umur 24 jam sebanyak 10 ml disentrifus dengan kecepatan 3500 rpm selama 20 menit sehingga diperoleh endapan sel bakteri.
Endapan sel bakteri tersebut selanjutnya dicuci dengan cara ditambahkan bufer fosfat pH 7.0 dengan perbandingan 1:1 kemudian disentrifus dengan kecepatan
3500 rpm selama 20 menit dan diulang pencuciannya sebanyak 2 kali. Endapan sel tersebut kemudian disuspensikan kembali dalam 10 ml larutan bufer fosfat pH 7.0,
dikontakkan dengan ekstrak sirih pada dosis 1 dan 2 MIC vv, diinkubasikan kembali dalam inkubator bergoyang 150 rpm selama 24 jam. Dosis MIC ekstrak
etanol sirih sudah diketahui dari penelitian sebelumnya yaitu untuk E. coli 1 ; S. Typhimurium 0.9 ; S. aureus 0.7 ; B. cereus dan L. monocytogenes masing-
masing 0.1 serta 0.09 untuk P. aeruginosa. Setelah inkubasi, suspensi bakteri tersebut disentrifus dengan kecepatan 3500 rpm selama 20 menit sehingga diperoleh
filtrat dan filtrat ini selanjutnya diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm.
3. Pengujian Kebocoran Ca
2+
, K
+
dan Mg
2+
Hurst et al 1974
Suspensi ke enam bakteri uji umur 24 jam direaksikan dengan ekstrak etanol sirih hijau dosis 1 dan 2 MIC kemudian disentrifus atau dibuat pelet dan
selanjutnya endapan disuspensikan dalam 10 ml air bebas ion dan ditambahkan 1 ml HNO3. Suspensi tersebut kemudian diabukan, diukur total Ca
2+
, K
+
dan Mg
2+
dengan menggunakan AAS atomic absorbtion spectroscopy. Konsentrasi yang terdapat
55 dalam sel dinyatakan dalam mg gr berat kering masa sel dan sebagai kontrol adalah
suspensi bakteri yang tidak diperlakukan dengan ekstrak sirih.
4. Pengamatan Kerusakan Sel dengan mikroskop fluoresen Bunthof, 2002
Pengamatan kerusakan sel dilakukan terhadap E. coli Gram negatif dan B. cereus Gram positif. Bakteri-bakteri tersebut dipergunakan terlebih dahulu
ditumbuhkan dalam media nutrien broth NB selama 24 jam kemudian suspensi bakteri umur 24 jam dikontakkan dengan ekstrak sirih pada dosis 1 dan 2 MIC dan
diikubasikan dalam inkubator bergoyang 150 rpm selama 24 jam suhu 37 C.
Suspensi bakteri sebanyak 10 ml disentrifus dengan kecepatan 3500 rpm selama 20 menit sehingga diperoleh endapan sel bakteri. Selanjutnya ke dalam endapan
tersebut ditambahkan zat warna dengan jingga akridin 1 ml, didiamkan selama 2 menit kemudian dibilas dengan air steril sebanyak 2 kali. Selanjutnya air bilasan
tersebut dibuang dan endapan sel bakteri tersebut yang siap untuk diamati dengan mikroskop fluoresen. Untuk pengamatan, sel bakteri tersebut dibuat preparat tipis
diatas obyek gelas, dibiarkan kering lalu ditutup dengan gelas penutup dan selanjutnya diamati dengan mikroskop fluoresen. Pengamatan juga dilakukan
terhadap sel bakteri tanpa pemberian ekstrak sirih.
5. Pengamatan Perubahan Morfologi Sel dengan SEM Noor 2001; Jeol, 1995
