Pembuatan Ekstrak Sirih . Pengujian Kebocoran metabolit seluler Chia et al 2000

53 hidup dan yang mati. Sel yang hidup akan berwarna hijau sedangkan sel mati dengan akridin akan berwarna merah. Senyawa fenolik dan komponen aktif dari teh akan menyebabkan permukaan sel S. aureus berubah menjadi kasar dan tidak beraturan Nychas 1995; Miller dan Shah 1999. Tujuan dari penelitian adalah mengetahui pengaruh dari pemberian ekstrak sirih pada dosis MIC terhadap kerusakan sel bakteri uji diantaranya kebocoran metabolit seluler dan ion-ion logam K + , Ca 2+ dan Mg 2+ ; perubahan morfologi serta kemampuan bakteri dalam menyerap zat warna yang diamati dengan dengan SEM scanning electrone microscope dan mikroskop fluoresen. BAHAN DAN METODE Bahan dan Kultur Bakteri Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun sirih hijau yang diperoleh dari Yogyakarta. Bakteri uji yang digunakan adalah Bacilus cereus FNCC 057, Staphylococcus aureu, FNCC 047, Listeria monocytogenes FNCC 0156, Pseudomonas aeruginosa FNCC 063 dan Salmonella Typhimurium FNCC 0734 yang diperoleh dari Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi UGM; Escherichia coli ATCC yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Seafast South East Asia Food and Agricultural Science and Technology Center IPB. Bahan-bahan lain yang digunakan adalah media untuk pemeliharaan kultur nutrien broth dan nutrien agar serta bahan-bahan kimia untuk analisa.

1. Pembuatan Ekstrak Sirih .

Daun sirih yang telah dikeringkan dan dihaluskan diekstraksi menggunakan etanol 1: 4 dengan cara dihomogenisasi dalam shaker selama 24 jam dengan kecepatan rotasi 150 rpm. Filtrat tersebut kemudian diuapkan dalam rotavapor pada 54 suhu 50 C dan kemudian dihilangkan sisa pelarutnya dengan gas nitrogen, selanjutnya ekstrak siap digunakan untuk analisis.

2. Pengujian Kebocoran metabolit seluler Chia et al 2000

Analisis kebocoran sel dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer dan pengukuran absorbansi dilakukan pada panjang gelombang 260 nm untuk kandungan nitrogen dari asam nukleat dan panjang gelombang 280 nm untuk menentukan kandungan nitrogen dari protein. Suspensi ke enam jenis bakteri uji umur 24 jam sebanyak 10 ml disentrifus dengan kecepatan 3500 rpm selama 20 menit sehingga diperoleh endapan sel bakteri. Endapan sel bakteri tersebut selanjutnya dicuci dengan cara ditambahkan bufer fosfat pH 7.0 dengan perbandingan 1:1 kemudian disentrifus dengan kecepatan 3500 rpm selama 20 menit dan diulang pencuciannya sebanyak 2 kali. Endapan sel tersebut kemudian disuspensikan kembali dalam 10 ml larutan bufer fosfat pH 7.0, dikontakkan dengan ekstrak sirih pada dosis 1 dan 2 MIC vv, diinkubasikan kembali dalam inkubator bergoyang 150 rpm selama 24 jam. Dosis MIC ekstrak etanol sirih sudah diketahui dari penelitian sebelumnya yaitu untuk E. coli 1 ; S. Typhimurium 0.9 ; S. aureus 0.7 ; B. cereus dan L. monocytogenes masing- masing 0.1 serta 0.09 untuk P. aeruginosa. Setelah inkubasi, suspensi bakteri tersebut disentrifus dengan kecepatan 3500 rpm selama 20 menit sehingga diperoleh filtrat dan filtrat ini selanjutnya diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm.

3. Pengujian Kebocoran Ca