III. METODOLOGI UMUM Tempat dan Waktu
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Pangan dan Laboratorium Kimia Pangan Jurusan Ilmu dan Teknologi Pangan IPB Bogor; Laboratorium
Mikrobiologi Pangan , Laboratorium Kimia dan Biokimia Pangan , Pilot Plant Seafast Center IPB Bogor ; LaboratoriumHistologi Fakultas Kedokteran Hewan IPB Bogor;
Laboratorium Biomaterial MIPA Universitas Indonesia, Jakarta serta di NAMRU Jakarta. Penelitian ini dilangsungkan dari Maret 2002 sampai Juli 2006.
Bahan dan Alat Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun sirih Piper betle Linn. jenis hijau yang diperoleh dari Jogyakarta Gambar 2.1a Bahan-bahan lain yang
digunakan adalah pelarut etanol, etil asetat dan beberapa bahan lainnya seperti buffer cacodilat, buffer fosfat, zat warna jingga akridin, glutaraldehid, osmium, argon, gas
nitrogen, serta bahan-bahan lannya yang digunakan untuk analisis. Bakteri uji yang digunakan adalah Bacilus cereus FNCC 057, Staphylococcus
aureus, FNCC 047 Listeria monocytogenes FNCC 0156, Pseudomonas aeruginosa FNCC 063 dan Salmonella Typhimurium FNCC 0734 yang diperoleh dari Pusat
Antar Universitas Pangan dan Gizi UGM; Escherichia coli ATCC yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Seafast Center South East Asia Food and Agricultural
Science and Technology Center IPB. Bahan-bahan lain yang digunakan adalah media agar nutrient agar, media cair Nutrien broth untuk pemeliharaan dan penyegaran
kultur.
Alat
Peralatan yang digunakan meliputi shaker inkubator, vorteks, pompa vakum, sentrifus, rotavapor, tabung gas nitrogen, autoklaf, Spektrofotometer, AAS, oven,
29 mikroskop fluoresen , mikroskop elektron, neraca analitik, serta alat-alat gelas lainnya
yang digunakan untuk ekstraksi dan analisis.
Metodologi Penelitian
Penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahap yang meliputi 1 pemilihan jenis pelarut ; 2 pengujian aktivitas antibakteri ; 3 analisis kualitatif sirih hijau; 4
penentuan konsentrasi minimum penghambatan atau minimum inhibitory concentration MIC dan minimum bactericidal concentration MBC; 5 pengujian mekanisme
aktivitas antibakteri sirih hijau meliputi kebocoran metabolit seluler dan kebocoran ion- ion logam, pengamatan morfologi sel bakteri, pewarnaan ; 6 fraksinasi ekstrak sirih
hijau dan pengujian aktivitas antibakteri dari masing-masing fraksi; 7 identifikasi komponen penyusun ekstrak dan fraksi-fraksi ekstrak. Secara garis besar, diagram alir
tahapan penelitian dapat dilihat pada Gambar 3.1 . Persiapan daun sirih kering
Daun sirih hijau disortasi, dipisahkan daun dan tangkainya kemudian dicuci bersih dengan air kemudian dikeringkan dengan pengering vakum pada suhu 40
C selama 12 jam sampai diperoleh kadar air 10 . Daun sirih yang telah kering tersebut
selanjutnya dihaluskan sampai diperoleh bubuk halus dan siap diekstrak dengan air ataupun pelarut organik.
Pemilihan Jenis pelarut.
Bubuk sirih diekstraksi menggunakan tiga jenis pelarut yaitu masing-masing dengan air, etanol 96 dan etil asetat 1: 4 bv dengan cara dihomogenisasi dalam
shaker selama 24 jam dengan kecepatan rotasi 150 rpm. Filtrat-filtrat tersebut kemudian diuapkan dalam rotavapor pada suhu 50
C dan filtrat etanol dan etil asetat kemudian dihilangkan sisa pelarutnya dengan gas nitrogen. Ekstrak-ekstrak tersebut
kemudian diuji kemampuannya dalam menghambat pertumbuhan E. coli dan S. aureus
30 dengan metode difusi sumur. Ekstrak yang menunjukkan aktivitas penghambatan terkuat
akan dipilih untuk penelitian selanjutnya.
Penentuan MIC
Penentuan MIC dilakukan dengan metode tuang. Ekstrak sirih hijau dengan beberapa konsentrasi dikontakkan dengan ke enam bakteri uji selama 24 jam dalam
inkubator bergoyang 150 rpm dan dihitung jumlah koloni mikrobanya pada berbagai pengenceran. Konsentrasi ekstrak sirih hijau yang digunakan dalam penelitian ini
bervariasi mulai dari 0.01 vv sampai 2.5 vv. Nilai MIC atau kemampuan penghambatan diperoleh dengan menentukan konsentrasi yang menunjukkan
penurunan jumlah bakteri uji sebanyak 90 . Perhitungan dilakukan dengan metode Unal et al 2001 :
CFU ml kontrol - CFU ml perlakuan penghambatan = X 100
CFU ml kontrol
Identifikasi komponen ekstrak secara kualitatif Harbone, 1996
Identifikasi dilakukan terhadap ekstrak sirih hijau terpilih yang mempunyai aktivitas penghambatan kuat. Pengujian dilakukan secara kualitatif untuk mengetahui
golongan komponen yang terdapat dalam ekstrak sirih. Analisa kualitatif komponen penyusun ekstrak ekstrak terpilih yang dilakukan
meliputi: a.
Golongan fenolik Harbone, 1996 Sampel sebanyak 1 ml diteteskan pada spot plate, kemudian ditambahkan
NaOH 10 . Uji dikatakan positif bila terbentuk warna merah yang menandakan adanya senyawa fenol hidrokuinon.
b. Golongan alkaloid Harbone, 1996
Sampel sebanyak 1 ml dimasukkan ke dalam spot palte kemudian ditambahkan pereaksi dragendorf 3 tetes. Uji dikatakan positif bila terbentuk endapan warna
jingga.
31 c.
Golongan flavonoid Harbone, 1996 Sampel sebanyak 1 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian
ditambahkan dengan H
2
SO
4
pekat beberapa tetes sampai terbentuk warna merah jingga atau krem yang menunjukkan adanya flavonoid.
d. Golongan tanin Harbone, 1996
Sampel sebanyak 1 gram ditempatkan dalam wadah gelas piala, diencerkan dengan menambahkan aqudest panas 12 ml, kemudian didihkan selama 5 menit
dan disaring. Selanjutnya, filtrat yang diperoleh ditambahkan larutan FeCl
3
1 sampai terbentuk warna biru tua atau hijau kehitaman.
e. Golongan steroid dan triterpenoid Harbone, 1996
Untuk pengujian steroid dan triterpenoid digunakan sampel yang telah dikeringkan 1 mg dan dilarutkan dengan menambahkan kloroform 2 ml.
Kemudian ke dalam larutan tersebut ditambahkan aam asetat anhidrat 10 tetes dan H
2
SO
4
pekat 3 tetes. Selanjutnya campuran tersebut dikocok perlahan-lahan dan didiamkan beberapa menit. Uji positif untuk steroid bila terbentuk warna hijau
sedangkan untuk triterpenoid terbetuk warna merah sampai keunguan. f.
Golongan saponin Harbone, 1996 Sampel sebanyak 1 ml dimasukkan ke dalam wadah tabung reaksi,
ditambahkan aquqdest panas 10 ml, kemudian didinginkan dan dikocok-kocok selama 10 detik. Bila terdapat senyawa saponin maka akan terbentuk buih 1-10
cm yang stabil selama 10 menit dan dengan penambahan HCl 2 N buih tersebut tidak hilang.
32
Bubuk Daun Sirih kering
Gambar 3.1. Diagram alir tahapan penelitian Keterangan : 6 kultur bakteri uji : E. coli; S. Typhimurium; P. aeruginosa; S. aureus;
L. monocytogenes dan B. cereus Ekstraksi :
3 jenis pelarut : air, etanol 96 dan etil asetat PA
Diuapkan rotavapor
Dihembus N
2
Pemilihan Jenis Pelarut: uji aktivitas antibakteri : S. aureus dan E. coli
Fraksinasi ; identifkasi komponen
Ekstrak dengan pelarut terbaik
Uji fitokimia Penentuan MIC ;
MBC
MIC terpilih
Aplikasi pada 6 kultur
bakteri uji Analisis mekanisme antibakteri :
- kebocoran metabolit seluler ion-ion logam
- Morfologi pewarnaan
Uji aktivitas antibakteri 6 bakteri uji ; identifikasi fraksi
terpilih
33
Pengujian Kebocoran metabolit seluler Chia et al 2000
Analisis kebocoran sel dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer dan pengukuran absorbansi dilakukan pada panjang gelombang 260 nm untuk kandungan
nitrogen dari asam nukleat dan panjang gelombang 280 nm untuk menentukan kandungan nitrogen dari protein.
Suspensi ke enam jenis bakteri uji umur 24 jam sebanyak 10 ml disentrifus dengan kecepatan 3500 rpm selama 20 menit sehingga diperoleh endapan sel bakteri. Endapan
sel bakteri tersebut selanjutnya dicuci dengan bufer fosfat pH 7.0 dan diulang pencuciannya sebanyak 2 kali. Endapan sel tersebut kemudian disuspensikan kembali
dalam 10 ml larutan bufer fosfat pH 7.0, dikontakkan dengan ekstrak sirih pada dosis 0, 1 dan 2 MIC vv , diinkubasikan kembali dalam inkubator bergoyang 150 rpm selama
24 jam. Setelah inkubasi, suspensi bakteri tersebut disentrifus dengan kecepatan 3500 rpm selama 20 menit sehingga diperoleh filtrat dan filtrat ini selanjutnya diukur
absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm.
Pengujian Kebocoran Ca
2+
, K
+
, dan Mg
2+
Hurst et al 1974
Suspensi ke enam bakteri uji umur 24 jam direaksikan dengan ekstrak terpilih dosis 0, 1 dan 2 MIC kemudian di sentrifus atau dibuat pelet dan selanjutnya disuspensikan
dalam 10 ml air bebas ion dan ditambahkan 1 ml HNO3. Suspensi tersebut kemudian diabukan, diukur total Ca
2+
, K
+
dan Mg
2+
dengan menggunakan AAS atomic absorbtion spectroscopy. Konsentrasi yang terdapat dalam sel dinyatakan dalam mg gr
berat kering dan sebagai kontrol adalah suspensi bakteri yang tidak diperlakukan dengan ekstrak contoh.
Pengamatan Kerusakan Sel dengan mikroskop fluoresen Bunthof, 2002
Pengamatan kerusakan sel dilakukan terhadap bakteri E. coli Gram negatif dan B. cereus Gram positif. Sebelum dipergunakan, bakteri-bakteri tersebut ditumbuhkan
terlebih dahulu dalam media nutrien broth NB selama 24 jam kemudian suspensi
34 bakteri umur 24 jam dikontakkan dengan ekstrak sirih pada dosis 1 dan 2 MIC dan
diikubasikan dalam inkubator bergoyang 150 rpm selama 24 jam suhu 37 C.
Suspensi bakteri sebanyak 10 ml disentrifuse dengan kecepatan 3500 rpm selama 20 menit sehingga diperoleh endapan sel bakteri. Selanjutnya kedalam endapan tersebut
ditambahkan dengan jingga akridin 1 ml, didiamkan selama 2 menit kemudian dibilas dengan air steril sebanyak 2 kali. Untuk pengamatan, sel bakteri tersebut dibuat preparat
tipis diatas obyek gelas, dibiarkan kering lalu ditutup dengan gelas penutup dan selanjutnya diamati dengan mikroskop fluoresen. Pengamatan juga dilakukan terhadap
sel bakteri tanpa pemberian ekstrak sirih.
Pengamatan Perubahan Morfologi Sel dengan SEM Noor 2001; Jeol, 1995
Suspensi bakteri uji umur 24 jam dikontakkan dengan ekstrak sirih pada dosis 1 dan 2 MIC selama 24 jam. Selanjutnya suspensi bakteri tersebut disentrifus dengan
kecepatan 3500 rpm selama 20 menit, cairan dibuang untuk mendapatkan masa sel bakteri pelet, kemudian pelet dicuci dengan larutan buffer fosfat sebanyak 2 kali.
Pelet tersebut kemudian difiksasi dengan larutan glutaraldehida 2.5 dalam 0.1 M bufer sodium kakodilat pH 7.2 dan dibiarkan selama 90 menit. Selanjutnya dicuci
kembali dengan 0.05 M buffer kakodilat pH 7.2 , pencucian dilakukan sebanyak 2 kali dan pada masing-masing pencucian dibiarkan selama 20 menit. Tahap selanjutnya
adalah difiksasi kembali dengan larutan osmium tetraoksida 1 dalam bufer kakodilat 0.05 pH 7.2 selama 1-2 menit, dicuci dengan air bebas ion akuabides. Pencucian
diulang sebanyak 3 kali dan dari masing-msing pencucian tersebut pelet dibiarkan selama 2 menit. Selanjutnya, pelet dikeringkan dengan menggunakan etanol dengan
konsentrasi bertahap 25, 50, 75 dan 100 . Untuk masing-masing konsentrasi, perlakuan dengan etanol dibiarkan selama 10 menit dan diulang sebanyak 3 kali.
Suspensi bakteri tersebut kemudian disaring dengan menggunakan membran filter 0.2µ m, ditempelkan pada stub aluminium dan dilapisi dengan emas. Pelapisan dengan emas
dilakukan secara vakum 6-7 Pa selama 20 menit dan setelah dilapis emas maka preparat siap diamati dengan mikroskop elektron tipe Jeol JSM 5300 LV dengan pembesaran
20.000 kali.
35
Fraksinasi ekstrak sirih Sutedja dan Agustina, 1994
Fraksinasi ekstrak etanol sirih dilakukan dengan cara elusi pada kromatografi Kolom. Sebanyak 30 gram silika gel dibuat bubur dengan menambahkan kloroform
kemudian bubur kloroform tersebut dimasukkan ke dalam corong gelas dengan diameter 2.5 cm dan panjang 30 cm, pelarut dialirkan sehingga diperoleh adsorben silika keiselgel
60 dan dibiarkan semalam. Kemudian ke dalam kolom tersebut ditambahkan ekstrak sirih dan selanjutnya kolom di elusi dengan campuran kloroform: etanol dan asam
asetat dengan perbandingan 4 : 1: 1. Campuran pelarut yang digunakan untuk fraksinasi tersebut diperoleh dari hasil penelitian dengan menggunakan kromatografi lapis tipis
KLT, dimana campuran pelarut tersebut manghasilkan 8 spot yang terpisah. Fraksi- fraksi yang diperoleh volume yang ditampung untuk tiap fraksi adalah 10 ml kemudian
diuapkan dan dihilangkan pelarutnya menggunakan gas N2 sampai diperoleh volume yang sama untuk semua fraksi yaitu 2 ml.
Pengujian aktivitas antibakteri fraksi ekstrak sirih Garriga et al 1993
Kemampuan aktivitas antibakteri fraksi-fraksi ekstrak sirih hijau diuji terhadap enam jenis bakteri meliputi Gram positif dan Gram negatif seperti Bacilus cereus,
Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Salmonella Typhimurium dan Pseudomonas aeruginosa. Sebelum dipergunakan isolat bakteri
disegarkan terlebih dahulu dalam media cair Nutrient broth NB selama 24 jam. Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan menggunakan metode difusi
sumur dengan mengukur diameter penghambatan dari ekstrak tersebut terhadap masing- masing bakteri uji. Media nutrient agar 25 ml yang mengandung bakteri uji sebanyak
10
7
CFUml dituangkan ke dalam cawan petri steril dan dibiarkan membeku. Setelah membeku, kemudian pada media tersebut dibuat lubang-lubang atau sumur dengan
diameter 6 mm. Ke dalam lubang tersebut dimasukkan 50µl masing-masing fraksi-fraksi ekstrak sirih hijau yang diperoleh. Selanjutnya cawan diinkubasikan dalam inkubator dan
suhu 37 C selama 24 – 48 jam.
36
Identifikasi komponen penyusun ekstrak etanol dan fraksi ekstrak sirih.
Fraksi ekstrak sirih hijau dengan daya hambat terkuat dianalisis dengan GC-MS Gas Chromatography Mass Spectrofotometri QP 5050 a untuk diidentifikasi komponen-
komponen yang terkandung dalam ekstrak etanol sirih dan fraksi dengan aktivitas penghambatan terbaik. Contoh 0.2 µl disuntikkan pada GC-MS kondisi alat telah
diprogram dengan spesifikasi sebagai berikut: Kolom yang dipergunakan adalah kolom DB 17; gas pembawa Helium; suhu awal 50
C ditahan selama 5 menit, suhu akhir 250 C dengan laju kenaikan suhu 4
C per menit; tekanan 40-45 Kpa; suhu interface 230 C
dengan energi ionisasi 120 Kvkisaran masa 33-400. Identifikasi komponen dilakukan dengan mengacu pada pustaka Wiley 229 dan National Institute od Standards and
Technology NIST 62.
Analisis Data
Untuk mengetahui pengaruh perlakuan pemberian ekstrak sirih pada dosis MIC terhadap sel-sel bakteri uji dilakukan uji statistik dengan menggunakan program SPSS
11 dan uji lanjut Duncan
DAFTAR PUSTAKA
Bunthof C.J. 2002. Flow Cytometry, Fluorescent Probes and Flashing Bacteria. Thesis Wageningen University, Wageningen. The Netherlands.
Chia M.L., J. K. Preston dan C. I. Wei. 2000. Antibacterial Mechanism of Allyl Isothiocyanate. J. of Food Protection 63 6: 727 – 734.
Garriga M, H. M. Aymerich dan Monfort J. M. 1993. Bacteriocinogenic Activity of Lactobacilli from Fermentor Sausages. J. Appl Bacteria 75: 142-148.
Harbone J.B. 1996. Metode Fitokimia. Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan. Penerjemah Padmawinata K dan Sudiro I. ITB Bandung.
37 Hurst A., A. Hughes, D. L. Collins-Thompson dan B. G. Shah. 1974. Relationship
Between Loss of Magnesium and Loss of Salt Tolerance After Sublethal Heating of Staphylococcus aureus. Can. J. Microbiol. 20 : 1153-1155
Jeol. 1995. Specimen Preparation Methods for Scanning Electron Microscope. JEOL Application Note. Tokyo.
Noor R.R. 2001. Scanning Electron Microscope. Laboratorium Pemuliaan dan Genetika Ternak. Fakultas Peternakan IPB, Bogor.
Suteja L dan Agustina. 1994. Ekstraksi dan Fraksinasi Komponen Bioaktif Antimikroba Dalam Biji dan Daun Lada. JKTI, Vol 4- No. 2.
Unal. R., H. P. Fleming, R. F. Mc Feeters, R. L. Thompson, F. Breidt, JR dan F. G. Giesbrecht. 2001. Novels Quantitative Assays for Estimating the Antimicrobial
Activity of Fresh Garlic Juice. J. of Food Protection. 64 2: 189-194.
IV. AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK SIRIH HIJAU Piper betle Linn TERHADAP BAKTERI PATOGEN PANGAN