coli dan S. aureus dengan metode difusi sumur Garriga et al 1993. Ekstrak yang

40 ATCC yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Seafast South East Asia Food and Agricultural Science and Technology Center IPB. Metode Persiapan daun sirih kering Daun sirih hijau yang diperoleh dari pasar di Yogyakarta disortasi, dipisahkan daun dan tangkainya kemudian dicuci bersih dengan air kemudian dikeringkan dengan pengering vakum pada suhu 40 C selama 12 jam sampai diperoleh kadar air 10 . Daun sirih yang telah kering tersebut selanjutnya dihaluskan sampai diperoleh bubuk halus dan siap diekstrak dengan air ataupun pelarut organik. Ekstraksi sirih dan Pemilihan jenis pelarut. Bubuk sirih masing-masing sebanyak 25 gram diekstraksi menggunakan tiga jenis pelarut yaitu masing-masing dengan air, etanol 96 dan etil asetat perbandingan 1: 4 dengan cara dihomogenisasi dalam shaker selama 24 jam dengan kecepatan rotasi 150 rpm. Filtrat-filtrat tersebut kemudian diuapkan dalam rotavapor pada suhu 50 C dan filtrat etanol dan etil asetat kemudian dihilangkan sisa pelarutnya dengan gas nitrogen. Untuk memilih jenis pelarut yang mempunyai aktivitas antibakteri terkuat maka tiga jenis ekstrak tersebut diuji kemampuannya dalam menghambat pertumbuhan

E. coli dan S. aureus dengan metode difusi sumur Garriga et al 1993. Ekstrak yang

menunjukkan aktivitas penghambatan terkuat akan dipilih untuk penelitian selanjutnya. Penentuan MIC dan MBC Ekstrak etanol sirih hijau dengan beberapa konsentrasi dikontakkan dengan ke enam bakteri uji dalam media NB selama 24 jam dalam inkubator bergoyang 150 rpm dan dihitung jumlah koloni mikrobanya pada berbagai pengenceran. Konsentrasi ekstrak sirih hijau yang digunakan dalam penelitian ini bervariasi mulai dari 0.01 vv sampai 2.5 vv. Nilai MIC atau kemampuan penghambatan diperoleh dengan menentukan konsentrasi yang menunjukkan penurunan jumlah bakteri uji sebanyak 90 dan 99 untuk nilai MBC. Perhitungan dilakukan dengan metode Unal et al 2001 : 41 CFU ml kontrol - CFU ml perlakuan penghambatan = X 100 CFU ml kontrol Identifikasi komponen ekstrak secara kualitatif Harbone, 1996 Identifikasi dilakukan terhadap ekstrak sirih terpilih yang mempunyai aktivitas penghambatan kuat. Pengujian dilakukan secara kualitatif untuk mengetahui golongan komponen yang terdapat dalam ekstrak sirih yang meliputi meliputi golongan fenolik, alkaloid, flavonoid, tanin, saponin, steroid dan triterpenoid dan metode analisa yang digunakan adalah metode Harbone 1996. HASIL DAN PEMBAHASAN Pengaruh jenis pelarut ekstrak sirih Pemilihan jenis pelarut dengan menggunakan metode difusi sumur terhadap bakteri uji E. coli dan S. aureus menunjukkan bahwa ketiga jenis pelarut yaitu air, etanol dan etil asetat secara umum mempunyai kemampuan menghambat bakteri uji yang beragam 10-24 mm. Dari ketiga jenis pelarut yang digunakan Gambar 4.1, ekstrak dengan air mempunyai kemampuan menghambat bakteri uji terendah disusul kemudian pelarut etil asetat dan etanol. Ekstrak air mempunyai kemampuan penghambatan terhadap E. coli dengan diameter penghambatan 10 mm dan 11.5 mm untuk S. aureus. Ekstrak etil asetat mampu menghambat pertumbuhan bakteri dengan diameter penghambatan yang lebih tinggi dari pada ekstrak air yaitu 12.7 mm untuk E. coli dan 16 mm untuk S. aureus. Dari hasil penelitian ini, ekstrak etanol lebih efektif menghambat S. aureus 24 mm bila dibandingkan dengan E. coli 14 mm. Kemampuan menghambat dari masing-masing pelarut terhadap E. coli dapat dilihat pada Gambar 4.2. Dengan analisis statistik lebih lanjut uji Duncan, Lampiran 1 dan Lampiran 1.1 , pelarut etanol berbeda nyata terhadap air dan pelarut etil asetat p 0.05. Hasil ini sesuai dengan penelitian dari Chou dan Yu 1985 dimana pelarut etanol 42 5 10 15 20 25 30 Air Etanol Etil asetat Jenis pelarut D ia m e te r p e n g h a m b a ta n m m E. coli S. aureus memberikan aktivitas antimikotik ekstrak sirih yang baik dan pelarut air mempunyai aktivitas yang lebih rendah terhadap beberapa jenis bakteri Yang dan Chou, 1997. Dari hasil penelitian pada tahap ini hasil uji statistik, pelarut etanol memberikan perbedaan yang nyata bila dibandingkan dengan pelarut air dan etil asetat maka untuk penelitian selanjutnya dipilih ekstrak etanol untuk diteliti lebih lanjut. Pemilihan pelarut merupakan faktor penting pada saat akan mengekstrak karena masing-masing pelarut akan mengekstrak komponen tertentu. Menurut Cowan 1999, untuk menseleksi awal kemungkinan tumbuh-tumbuhan mempunyai aktivitas antimikroba maka untuk mengekstraksinya dapat digunakan air, alkohol atau pelarut organik yang lainnya. Dengan pelarut air, komponen aktif yang dapat terekstrak adalah antosianin, tanin, saponin dan terpenoid. Dengan pelarut etanol akan terekstrak tanin, terpenoid, alkaloid, sterol dan polifenol. Sedangkan dengan pelarut etil asetat komponen aktif yang terekstrak adalah steroid, terpenoid, alkaloid, flavonoid dan glikosida. Gambar 4.1. Pengaruh jenis pelarut terhadap aktivitas penghambatan pertumbuhan E. coli dan S. aureus. Perbedaan kemampuan menghambat dari masing-masing pelarut diduga mungkin komponen aktif yang terdapat pada daun sirih hijau. Menurut Jenn dan Chou 1997, dalam daun sirih terdapat eugenol dan hidroksikavikol yang mempunyai aktivitas antimikroba. Menurut Jenie et al 2001 dan Duke 2002, dalam daun sirih dapat 43 ditemukan adanya bahan kimia yang mempunyai aktivitas antibakteri yaitu: kavikol, kavibetol, tanin, eugenol, karvakrol, kariofilene dan asam askorbat a b Gambar 4.2. Pengaruh jenis pelarut air dan etanol a; etanol dan etil asetat b dari ekstrak sirih terhadap kemampuan menghambat pertumbuhan E. coli. Keterangan : 1 : ekstrak air; 2 : ekstrak etanol ; 3 : ekstrak etil asetat Untuk menseleksi dan mengisolasi komponen antimikroba dari tanaman Anthoeleista grandiflora dan Combretum erythrophyllum, Eloff 1998 menggunakan beberapa pelarut diantaranya aseton, etanol, metanol, metilen diklorid, campuran metanol atau kloroform dan air 1:1 ternyata aseton merupakan pelarut yang baik. Menurut Yang dan Chou 1997, air dapat digunakan sebagai pelarut tetapi aktivitas antimikrobanya rendah atau bahkan tidak menghambat mikroba Streptococcus salivarius, S. sanguis, S. mutans, Neisseria sp., Salmonella sp., S. aureus, Yersinia enterocolitica dan L. monocytogenes. Penelitian dari Sutedja dan Agustina 1994, untuk mendapatkan ekstrak daun dan biji lada digunakan pelarut yang berbeda kepolarannya. Hasil yang diperoleh dari penelitiannya ternyata ekstrak air, kloroform dan metanol dari biji lada mempunyai aktivitas antimikroba terhadap S. aureus dan C. albicans sedangkan ekstrak haksan tidak mempunyai aktivitas antimikroba. Ekstrak dari daun lada tidak mempunyai aktivitas antimikroba. 1 1 2 2 3 3 44 Dari beberapa penelitian untuk memperoleh komponen aktif dari sirih dapat digunakan beberapa pelarut diantaranya adalah etanol, air, petroleum dan lain-lain. Sarkar et al 2000 mengekstraksi daun sirih dengan cara merendam irisan daun sirih dalam pelarut etil alkohol 90 selama 20 sampai 30 hari. Sukarminah 1997 menggunakan cara destilasi uap dan pelarut etanol untuk memperoleh komponen aktif dari daun sirih baik yang volatil, non volatil maupun campuran keduanya. Dari hasil yang diperoleh, air sulit mengekstrak komponen antimikroba daun sirih bila dibandingkan dengan etanol. Chou dan Yu 1985 menggunakan pelarut kloroform, etanol dan air baik secara sendiri-sendiri atau campuran untuk menguji pengaruh ekstrak daun sirih terhadap pertumbuhan dan produksi aflatoksin A. parasiticus dan ternyata ekstrak kloroform dan etanol mempunyai aktivtas antimikotik yang lebih baik. Konsentrasi minimum penghambatan MIC dan MBC Konsentrasi minimum penghambatan MIC dari ekstrak sirih hijau terhadap ke enam jenis bakteri uji yang digunakan bervariasi antara 0.1 sampai 1 Gambar 4.3 sedangkan nilai MBC terhadap ke enam jenis bakteri uji bervariasi antara 0.15 – 1.5 . 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 E . c ol i S . T yp hi m ur iu m S . a ur eu s B . c er eu s L. m on oc yt og en es P . a er ug in os a Jenis bakteri M IC Gambar 4.3. Konsentrasi minimum penghambatan MIC ekstrak sirih hijau terhadap bakteri uji 45 Dari Gambar 4.3 terlihat bahwa nilai MIC bakteri Gram positif yang paling tahan adalah 0.5 S. aureus Lampiran 2; bakteri Gram negatif E. coli 1 Lampiran 2.1 dan 0.7 untuk S. Typhimurium Lampiran 2.2. Bakteri uji yang lainnya yaitu B. cereus dan L. monocytogenes dapat dihambat pertumbuhannya pada nilai MIC 0.1 Lampiran 2.3 dan Lampiran 2.4, sedangkan P. aeruginosa MIC 0.09 Lampiran 2.5. Nilai MBC untuk bakteri S. aureus adalah pada 2 MIC atau pada konsentrasi 1 ; MBC E. coli pada konsentrasi 1.5 ; 1.2 untuk S. Typhimurium; 0,15 untuk B. cereus dan L. monocytogenes serta 0.17 untuk P. aeruginosa. Hasil penelitian dari Sukarminah 1997, ekstrak sirih yang diperoleh dengan menggunakan pelarut etanol mempunyai efek bakterisidal terhadap P. aeruginosa, S. aureus dan S. Typhimurium pada konsentrasi 0.025 sampai 0.1 vv. Dari hasil penelitian Sugiastuti 2002, nilai MIC ekstrak etanol sirih kuning 2 mgml bv terhadap E. coli, S. Typhimurium dan P. aeruginosa sedangkan terhadap S. aureus adalah 3 mgml. Dari hasil penelitian ini ternyata ekstrak etanol sirih efektif menghambat semua bakteri uji dan pada umumnya bakteri Gram negatif kecuali P. aeruginosa lebih tahan bila dibandingkan dengan bakteri Gram positif. Bakteri Gram positif sebagian besar dinding selnya disusun oleh lapisan peptidoglikan dan asam teikoat sehingga mudah dilewati oleh komponen yang bersifat hidrofilik. Eugenol yang merupakan komponen aktif dari cengkeh mempunyai aktivitas antibakteri terhadap E. coli dan B. subtilis Bennis et al 2004 dan kerusakan yang terjadi antara kedua bakteri tersebut berbeda disebabkan karena adanya perbedaan struktur sel yang berbeda. Perbedaan kemampuan menghambat ini selain disebabkan karena perbedaan komponen penyusun dinding sel diduga juga disebabkan karena jenis komponen aktif yang terkandung dalam ekstrak. Dari hasil penelitian yang diperoleh Lin et al 2000 bakteri gram negatif E. coli O157: H7 dan Salmonella Montevideo lebih peka terhadap perlakuan minyak atsiri Allium sp yaitu alil isotiosianat. Demikian juga hasil yang diperoleh Zaika 1988 didalam Dorman dan Dean 2000 dan Prabuseenivasan 2006 dimana bakteri Gram positif lebih tahan terhadap minyak atsiri tanaman dari pada bakteri Gram negatif. Ekstrak etanol dari beberapa tanaman familia Lamiacea tidak mempunyai aktivitas antimikroba terhadap bakteri Gram negatif tetapi mampu 46 menghambat bakteri Gram positif dengan diameter penghambatan antara 7-18 mm Sarac dan Ugur , 2007. Dari penelitian yang dilakukan Dorman dan Dean 2000 , diperoleh hasil bahwa minyak atsiri oregano Origanum. vulgare, lada hitam Piper nigrum , cengkeh Syzygium aromaticum , thymus Thymus vulgaris dan pala Myristica fragrans mempunyai aktivitas penghambatan terhadap bakteri Gram positif B. subtilis dan S. aureus. Beberapa ekstrak misalnya minyak atsiri dari pala Myristica fragrans tidak menghambat pertumbuhan bakteri Gram negatif Enterobacter aerogenes dan Pseudomonas aeruginosa tetapi efektif menghambat pertumbuhan E. coli dan Salmonella pullorum. Penelitian dari Nalina dan Rahim 2007 diperoleh hasil bahwa ekstrak sirih efektif menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif Streptococcus mutans. Identifikasi komponen ekstrak Secara kualitatif ekstrak etanol sirih hijau positif mengandung komponen aktif seperti alkaloid, tanin, fenolik dan steroid Tabel 4.1 dengan komponen yang positif kuat yaitu fenolik dan senyawa ini berperan sebagai senyawa antimikroba. Tabel 4.1. Hasil analisis komponen aktif ekstrak etanol sirih Komponen Hasil Alkaloid ++ Tanin ++ Flavonoid - Fenolik +++ Triterpenoid - Steroid + Keterangan : - : negatif + : positif lemah + + : positif +++ : positif kuat Menurut Duke 2002, komponen dalam daun sirih yang mempunyai aktivitas antimikroba adalah eugenol, tanin, karvakrol, kariofilen, p-simen dan asam askorbat. Di dalam ekstrak sirih Srilankan dengan cara destilasi selain eugenol ditemukan juga komponen safrole, alilpirokatekol asetat, eugenil asetat Mohottalage et al 2006. Dari penelitian Nalina dan Rahim 2007 diketahui bahwa ekstrak sirih mengandung 47 hidroksikavibetol yang mempunyai aktivitas menghambat pertumbuhan bakteri. Selain itu ditemukan juga adanya asam seperti asam stearat, palmitat yang juga dapat menghambat pertumbuhan mikroba. Dalam daun sirih terdapat komponen aktif hidroksikavikol dengan spektrum penghambatan yang luas terhadap bakteri patogen seperti Raistonia, Xanthomonas dan Erwinia FFTC, 2003. Suriyaphan 2003, dengan cara destilasi dengan menggunakan pelarut kloroform didalam ekstrak sirih ditemukan adanya kavibetol dan linalol. Fenol adalah substansi yang mempunyai cincin aromatik dengan satu atau lebih gugus hidroksil dan dapat dibedakan dalam fenol sederhana dan asam fenol . Yang termasuk dalam golongan fenol dan mempunyai kemampuan sebagai bahan antimikroba diantaranya adalah katekol, pirogalol, quinon, eugenol, flavon dan flavonoid, tanin, kumarin dan lainnya. Fenol dapat berperan sebagai racun bagi mikroba yaitu dengan menghambat aktivitas enzim, berikatan dengan gugus sulfhidril dan protein. Flavonoid dapat berfungsi sebagai bahan antimikroba dengan membentuk ikatan komplek dengan dinding sel dan merusak membran. Salah satu contoh flavonoid adalah katekin yang mampu menghambat pertumbuhan V. cholerae, Streptococcus mutans, Shigella dan bakteri –bakteri yang lainnya. Tanin adalah polimer fenolik yang biasanya digunakan sebagai bahan penyegar, mempunyai sifat antimikroba dan bersifat racun terhadap khamir, bakteri dan kapang. Kemampuan tanin sebagai bahan antimikroba diduga karena tanin akan berikatan dengan dinding sel bakteri sehingga akan menginaktifkan kemampuan menempel bakteri, menghambat pertumbuhan, aktivitas enzim protease dan dapat membentuk ikatan komplek dengan polisakarida Cowan, 1999. Alkaloid mempunyai pengaruh sebagai bahan antimikroba terhadap Entamuba sp penyebab diare dan mekanisme penghambatannya adalah dengan mengkelat DNA. SIMPULAN Beberapa simpulan yang dapat diambil dari hasil penelitian adalah bahwa ekstrak etanol sirih hijau mempunyai aktivitas sebagai bahan antibakteri baik terhadap bakteri 48 Gram positif maupun bakteri Gram negatif dengan konsentrasi minimum penghambatan MIC bervariasi antara 0.1 sampai 1 dan nilai MBC bervariasi antara 0.15 sampai 1.5 . Pada umumnya bakteri Gram negatif kecuali P. aeruginosa lebih tahan terhadap perlakuan ekstrak etanol sirih bila dibandingkan dengan bakteri Gram positif. Bakteri yang paling peka terhadap ekstrak etanol sirih berturut-turut adalah P. aeruginosa, B. cereus dan L. monocytogenes sedangkan bakteri yang paling tahan berturut-turut adalah E. coli, S. Typhimurium dan S. aureus. DAFTAR PUSTAKA Ardiansyah. 2003. Kajian Aktivitas Antimikroba Ekstrak Daun Beluntas Plucea indica L.. Tesis Program Pasca Sarjana IPB. Bogor Bennis S., F. Chami, N. Chami, K. Rhayour, A. T. Elaraki dan A. Remmal. 2004. Eugenol Induces Damage of Bacterial and Fungal Envelope. Moroccan J. Biol. I. 33-39. Chia M.L., J. K. Preston dan C. I. Wei. 2000. Antibacterial Mechanism of Allyl Isothiocyanate. J. of Food Protection 63 6: 727 – 734. Chou C.C dan Yu R.C. 1985. Effect of Piper betle L and its Extracts on the Growth and Aflatoxin Production by Aspergillus parasiticus. Proc. Natl Sci Coune Repub China B. 1984 Jan; 8 1: 30-35. httpw.w.w. ncbi.nlm.nih.goventrezquery.fcgi?cmd-retievedbList_uids-6531413dopt- Abstract. Cowan M.M. 1999. Plant Product as Antimicrobial Agents. J, Microbiology Reviews. 12 4 : 564-582. Duke’s. 2002. Phytochemical and Ethnobotanical Database. httpwww.dr.duke’s.phytochemical and ethnobotanicaldatabase.com. 2182002. Elgayyar M.; F. A. Draughon , D. A. Golden dan J. R. Mount. 2000. Antimicrobial Activity of Essential Oils from Plants against Selected Pathogenic and Saprophytic Microorganisms. J. of Food Protection 64 2: 1019-1024. Food and Fertilizer Technology Center FFTC. 2003. Antibacterial Property of Piper betle L. FFTC Resaerch Highlights. . Taipei, Taiwan ROC. 49 Garriga M, H. M. Aymerich dan Monfort J. M. 1993. Bacteriocinogenic Activity of Lactobacilli from Fermentor Sausages. J. Appl Bacteria 75: 142-148. Harapini M; A. Agusta dan R. D. Rahayu 1996. Analisis Komponen Kimia Minyak Atsiri dari Dua Macam Sirih daun kuning dan hijau. Prosiding Simposium Nasional I Tumbuhan Obat dan Aromatika. Bogor 10-12 Oktober 1995. Harbone J.B. 1996. Metode Fitokimia. Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan. Penerjemah Padmawinata K dan Sudiro I. ITB Bandung. Jawetz E, Melnick J dan Adelberg E. 1996. Medical Microbiology. Appleton Large. San Fransisco. Jenie B. S. L.. et al. 2001. Antimicrobial Activity of Piper betle Linn Extract Towards Foodborne Pathogens and Spoilage Microorganisms. Httpift. Confex.com ift 2001 technoprogram paper.9068. htm. Kubo I, Muroi H dan Kubo A. 1995. Antibacterial Activity of Long-chain Alcohols against Streptococcus mutans. J. Agric. Food Chem 40 6: 999- 1003. Mohottalage S., R. Tabacchi dan P. M. Guerin. 2006. Components from Srilankan Piper betle L. Leaf Oil and their Analogies Showing Toxicity against the Housefly, Musa domestica. Research Article. University of Neuchatel, Switzerland. Nalina T dan Z. H. A Rahim. 2007. The Crude Aqueous Extract of Piper betle L . and Its Antibacterial Effect Towards Streptococcus mutans. American Journal of Biotechnology and Biochemistry 3 1 : 10-15. Naufalin R et al. 2005. Aktivitas Antibakteri Ekstrak Bunga Kecombrang Terhadap Bakteri Patogen dan Perusak Pangan. Jurnal Teknol. Dan Industri Pangan, Vol. XV. No 2. 2005. Parhusip A.J.N. et al 2005. Pengaruh Ekstrak Andaliman Zanthoxylum acanthopodium DC Terhadap Permeabilitas dan Hidrofobisitas Bacillus cereus. Jurnal Teknol. Dan Industri Pangan, Vol. XV. No 1. 2005. Rahaju W.P. 1999. Kajian Aktivitas Antimikroba Ekstrak dan Fraksi Rimpang Lengkuas Alpinia galangan L Swartz Terhadap Mikroba Patogen dan Perusak Makanan. Disertasi. Program Pasca Sarjana IPB, Bogor. Sarac N dan A. Ugur. 2007. Antimicrobial Activities and Usage in Folkloric Medicine of some Lamiaceae Species Growing in Mugla, Turkey. EurAsia J. of Biosciences 4, 28-37. 50 Sugiastuti S. 2002. Kajian Aktivitas Antibakteri dan Antioksidan Ekstrak Daun Sirih Piper betle L Pada Daging Sapi Giling. Tesis. Program Pasca Sarjana. Institut Pertanian Bogor. Suriyaphan O. 2003. Identification of Key Aroma Component of Piper betle Linn. Leaf. http:ift.confex.comift2003technoprogrampaper 18487.htm . 15 Juni 2007. Suteja L dan Agustina. 1994. Ekstraksi Dan Fraksinasi Komponen Bioaktif Antimikroba Dalam Biji dan Daun Lada. JKTI, Vol 4- No. 2. Desember. 1994. Unal. R.. et al. 2001. Novels Quantitative Assays for Estimating the Antimicrobial Activity of Fresh Garlic Juice. J. of Food Protection. 64 2: 189-194. Yang J. N. dan C. C. Chou. 1997. Antimicrobial Activity of Various Solvent Extracts of Betel Quid Ingridients. Food Science. Taiwan. 24 5: 497-505. Yin M.C. dan W.S. Cheng. 1977. Inhibition of Aspergillus niger and Aspergillus flavus by Some Herbs and Spices. J. of Protections 61 1: 123-125

V. PENGARUH EKSTRAK SIRIH HIJAU Piper betle Linn TERHADAP KEBOCORAN METABOLIT SELULER DAN MORFOLOGI