natrium hidroksida, asam klorida pekat, metanol teknis, eter minyak tanah teknis, etil asetat teknis, serbuk seng, serbuk magnesium, isopropanol,
karboksi metil selulosa CMC teknis, larutan giemsa, minyak emersi, siklofosfamid, serum darah sapi, NaCl 0,9.
3.2 Hewan Percobaan
Hewan yang digunakan pada penelitian ini adalah mencit jantan berumur 2-3 bulan dengan berat badan 20-30 g. Sebelum percobaan dimulai, terlebih
dahulu mencit dipelihara selama 2 minggu dalam kandang yang baik untuk menyesuaikan lingkungannya. Gambar hewan percobaan dapat dilihat pada
Lampiran 7, halaman 53.
3.3 Pembuatan Larutan Pereaksi 3.3.1 Larutan Pereaksi Mayer
Sebanyak 5 g kalium iodida dalam 10 ml air suling kemudian ditambahkan larutan 1,36 g merkuri II klorida dalam 60 ml air suling. Larutan dikocok dan
ditambahkan air suling hingga 100 ml Ditjen POM, 1995.
3.3.2 Larutan Pereaksi Dragendorff
Sebanyak 8 g bismut nitrat dilarutkan dalam asam nitrat pekat 20 ml kemudian dicampur dengan larutan kalium iodida sebanyak 27,2 g dalam 50 ml
air suling. Campuran didiamkan sampai memisah sempurna. Larutan jernih diambil dan diencerkan dengan air secukupnya hingga 100 ml Ditjen POM,
1995.
3.3.3 Larutan Pereaksi Bouchardat
Universitas Sumatera Utara
Sebanyak 4 g kalium iodida dilarutkan dalam 20 ml air suling kemudian ditambah 2 g iodium sambil diaduk sampai larut, lalu ditambah air suling hingga
100 ml Ditjen POM, 1995.
3.3.4 Larutan Pereaksi Molish
Sebanyak 3 g α-naftol dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N secukupnya
hingga diperoleh larutan 100 ml Ditjen POM, 1995.
3.3.5 Larutan Pereaksi Liebermann-Burchard
Sebanyak 2 bagian asam asetat anhidrat dicampurkan dengan 1 bagian asam sulfat pekat Harborne, 1987.
3.3.6 Larutan Pereaksi Besi III Klorida 1
Sebanyak 1 g besi III klorida dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml kemudian disaring Ditjen POM, 1995.
3.3.7 Larutan Pereaksi Timbal II Asetat
Sebanyak 15,17 g timbal II asetat ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml Ditjen POM, 1995.
3.3.8 Larutan Pereaksi Natrium Hidroksida 2 N
Sebanyak 8 g kristal natrium hidroksida dilarutkan dalam air suling hingga diperoleh larutan 100 ml Depkes RI, 1979.
3.3.9 Larutan Pereaksi Asam Klorida 2 N
Sebanyak 17 ml asam klorida pekat diencerkan dengan air suling sampai 100 ml
Depkes RI, 1979.
3.4 Identifikasi Tumbuhan
Universitas Sumatera Utara
Identifikasi sampel dilakukan di Herbarium Medanense MEDA,
Universitas Sumatera Utara. Hasil identifikasi tumbuhan dapat dilihat pada
Lampiran 1, halaman 41.
3.5 Pengumpulan dan Pengolahan Sampel 3.5.1 Pengumpulan Sampel
Pengumpulan sampel dilakukan secara purposif, yaitu tanpa membandingkan dengan daerah lain. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini
adalah daun ceremai yang diambil dari Kampung Durian, Medan, Sumatera Utara. Daun yang diambil sebagai sampel adalah daun tumbuhan yang muda. Gambar
tumbuhan ceremai dapat dilihat pada Lampiran 2, halaman 42.
3.5.2 Pengolahan Sampel
Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah daun ceremai yang masih segar. Daun dipisahkan dari pengotor lain lalu dicuci hingga bersih
kemudian ditiriskan dan ditimbang. Diperoleh berat basah sebesar 1.700 g. Selanjutnya daun tersebut dikeringkan selama 10 hari dalam lemari pengering
dengan temperatur ±40
o
C sampai daun kering ditandai bila diremas rapuh. Simplisia yang telah kering diblender menjadi serbuk lalu dimasukkan ke dalam
wadah plastik bertutup dan di simpan pada suhu kamar. Kemudian serbuk ditimbang. Diperoleh berat kering sebesar 600 g.
3.6 Pemeriksaan Karakterisasi Simplisia
Universitas Sumatera Utara
Pemeriksaan karakterisasi simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik dan mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar abu total, penetapan kadar
abu tidak larut dalam asam, penetapan kadar sari larut dalam air, penetapan kadar sari larut dalam etanol.
3.6.1 Pemeriksaan Makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan cara mengamati warna, bentuk, ukuran dan tekstur dari simplisia. Gambar simplisia daun ceremai dapat
dilihat pada Lampiran 2, halaman 42.
3.6.2 Pemeriksaan Mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik terhadap simplisia dilakukan dengan cara menaburkan serbuk simplisia di atas kaca objek yang telah diteteskan dengan
larutan kloralhidrat dan ditutup dengan kaca penutup kemudian diamati di bawah mikroskop. Hasil pengamatan mikroskopik terhadap simplisia dapat dilihat pada
Lampiran 2, halaman 43.
3.6.3 Penetapan Kadar Air
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi destilasi toluena. Cara Kerja: toluena sebanyak 200 ml dan air suling sebanyak 2 ml
dimasukkan ke dalam labu alas bulat, didestilasi selama 2 jam. Toluena didinginkan selama 30 menit dan volume air dalam tabung penerima dibaca
WHO, 1998. Kemudian ke dalam labu tersebut dimasukkan 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama, labu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah
toluena mendidih, kecepatan tetesan diatur 2 tetes tiap detik sampai sebagian besar air terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 tetes tiap
detik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan
Universitas Sumatera Utara
toluena. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluena memisah
sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang
diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen Ditjen POM, 1995.
3.6.4 Penetapan Kadar Abu Total
Sebanyak lebih kurang 2 g sampai 3 g zat yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan dalam krus porselen yang telah dipijar dan ditara,
kemudian diratakan. Krus dipijarkan perlahan-lahan hingga arang habis, kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu
total dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Ditjen POM, 1995.
3.6.5 Penetapan Kadar Abu Tidak Larut Asam
Abu yang telah diperoleh dari penetapan kadar abu total dididihkan dalam 25 ml asam klorida 2 N selama 5 menit. Bagian yang tidak larut dalam asam
dikumpulkan, disaring melalui kertas saring, dipijarkan hingga bobot tetap kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu yang tidak larut dalam asam
dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Ditjen POM, 1995.
3.6.6 Penetapan Kadar Sari Larut dalam Air
Sebanyak 5 g serbuk dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air kloroform 2,5 ml kloroform dalam air suling sampai 1000 ml dalam labu
bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama kemudian dibiarkan selama 18 jam dan disaring. Sejumlah 20 ml filtrat pertama diuapkan sampai
kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara. Sisa dipanaskan
Universitas Sumatera Utara
dalam oven pada suhu 105
o
C sampai diperoleh bobot konstan. Kadar sari yang larut di dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara
Ditjen POM, 1995.
3.6.7 Penetapan Kadar Sari Larut dalam Etanol
Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan di udara dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96 dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali
selama 6 jam pertama dan kemudian dibiarkan selama 18 jam dan disaring. Sejumlah 20 ml filtrat pertama diuapkan sampai kering dalam cawan dangkal
berdasar rata yang telah ditara. Sisa dipanaskan dalam oven pada suhu 105
o
C sampai diperoleh bobot konstan. Kadar sari yang larut dalam etanol dihitung
terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Ditjen POM, 1995. Hasil pemeriksaan karakterisasi simplisia daun ceremai dapat dilihat pada
Tabel 3.1., Lampiran 3, halaman 44.
3.7 Pemeriksaan Skrining Fitokimia Serbuk Simplisia 3.7.1 Pemeriksaan Alkaloida
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 2
menit, didinginkan lalu disaring. Filtrat dipakai untuk percobaan berikut:
a. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan 2 tetes larutan pereksi Mayer akan terbentuk endapan berwarna putih atau kuning
b. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan 2 tetes larutan pereksi Bouchardat akan terbentuk endapan berwarna coklat-hitam
Universitas Sumatera Utara
c. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan 2 tetes larutan pereksi Dragendorff akan terbentuk endapan berwarna merah atau jingga
Alkaloida dinyatakan positif jika terjadi endapan atau paling sedikit dua atau tiga dari percobaan di atas Ditjen POM, 1995.
3.7.2 Pemeriksaan Flavonoida
Larutan Percobaan: Sebanyak 0,5 g sampel disari dengan 10 ml metanol lalu direfluks selama
10 menit, disaring panas-panas melalui kertas saring berlipat, filtrat diencerkan dengan 10 ml air suling. Setelah dingin ditambah 5 ml eter minyak tanah, dikocok
hati-hati, didiamkan. Lapisan metanol diambil, diuapkan pada temperatur 40
o
C. Sisa dilarutkan dalam 5 ml etil asetat, disaring.
Cara Percobaan: a. Satu ml larutan percobaan diuapkan hingga kering, sisanya dilarutkan dalam
1-2 ml etanol 96, ditambahkan 0,5 g serbuk seng dan 2 ml asam klorida 2 N, didiamkan selama satu menit. Ditambahkan 10 ml asama klorida pekat,
jika dalam waktu 2-5 menit terjadi warna merah intensif menunjukkan adanya flavonoida glikosida-3-flavonol
b. Satu ml larutan percobaan diuapkan hingga kering, sisanya dilarutkan dalam 1 ml etanol 96, ditambahkan 0,1 g magnesium dan 10 ml asam klorida
pekat, terjadi warna merah jingga sampai merah ungu menunjukkan adanya flavonoida Ditjen POM, 1995.
3.7.3 Pemeriksaan Tanin
Universitas Sumatera Utara
Sebanyak 0,5 g sampel disari dengan 10 ml air suling, disaring lalu filtratnya diencerkan dengan air suling sampai tidak berwarna. Diambil 2 ml
larutan lalu ditambahkan 1 sampai 2 tetes pereaksi besi III klorida. Terjadi warna biru atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin Farnsworth, 1966.
3.7.4 Pemeriksaan Glikosida
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 3 g kemudian disari dengan 30 ml campuran 7 bagian volume etanol 96 dan 3 bagian volume air suling,
selanjutnya ditambahkan 10 ml HCl 2 N, direfluks selama 10 menit, didinginkan dan disaring. Pada 30 ml filtrat ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II
asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan selama 5 menit lalu disaring. Filtrat disari sebanyak 3 kali, tiap kali dengan 20 ml campuran 3 bagian volume kloroform dan
2 bagian volume isopropanol. Diambil lapisan air kemudian ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes pereaksi Molisch, ditambahkan hati-hati 2 ml asam sulfat pekat
terbentuk cincin warna ungu pada batas kedua cairan menunjukkan adanya ikatan gula Ditjen POM, 1995.
3.7.5 Pemeriksaan Saponin
Sebanyak 0,5 g sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 10 ml air suling panas, didinginkan kemudian dikocok kuat-kuat
selama 10 detik, timbul busa yang mantap tidak kurang dari 10 menit setinggi 1- 10 cm. Ditambahkan 1 tetes larutan asam klorida 2 N, bila buih tidak hilang
menunjukkan adanya saponin Ditjen POM, 1995.
3.7.6 Pemeriksaan SteroidaTriterpenoida
Universitas Sumatera Utara
Sebanyak 1 g sampel dimaserasi dengan 20 ml eter selama 2 jam, lalu disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan penguap. Pada sisa dalam cawan penguap
ditambahkan 2 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat. Timbul warna ungu atau merah kemudian berubah menjadi hijau biru menunjukkan
adanya steroida triterpenoida Harborne, 1987. Hasil pemeriksaan skrining fitokimia simplisia daun ceremai dapat dilihat pada Tabel 3.2, Lampiran 3,
halaman 44.
3.8 Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Ceremai
Sebanyak 300 g serbuk simplisia dimasukkan ke dalam bejana tertutup dan dibasahi dengan etanol 96, kemudian dimaserasi selama 3 jam. Massa
dipindahkan sedikit demi sedikit ke dalam perkolator sambil tiap kali ditekan hati- hati, kemudian cairan penyari dituangkan secukupnya sampai cairan mulai
menetes dan di atas simplisia masih terdapat selapis cairan penyari, perkolator ditutup dan dibiarkan 24 jam. Cairan dibiarkan menetes dengan kecepatan 1 ml
tiap menit, cairan penyari ditambahkan berulang-ulang secukupnya dengan memasang botol cairan penyari di atas perkolator dan diatur kecepatan penetesan
cairan penyari sama dengan kecepatan menetes perkolat, sehingga selalu terdapat selapis cairan penyari di atas simplisia. Perkolasi dihentikan jika perkolat yang
keluar telah jernih. Perkolat yang diperoleh dipekatkan dengan alat rotary evaporator. Kemudian dikeringkan dengan freeze dryer selama lebih kurang 24
jam dan diperoleh ekstrak kental sebanyak 61,096 g Depkes RI, 1974. Flow sheet pembuatan ekstrak etanol daun ceremai dapat dilihat pada Lampiran 5,
halaman 50.
Universitas Sumatera Utara
3.9 Pemeriksaan Skrining Fitokimia Ekstrak Etanol Daun Ceremai
Ekstrak kental terlebih dahulu dilarutkan dalam etanol 96. Kemudian dilakukan pemeriksaan golongan senyawa kimia ekstrak. Prosedur pemeriksaan
golongan senyawa kimia ekstrak etanol daun ceremai dilakukan sama seperti prosedur untuk pemeriksaan skrining fitokimia serbuk simplisia. Hasil
pemeriksaan dapat dilihat pada Tabel 3.2, Lampiran 3, halaman 44.
3.10 Uji Efek antikanker
