BAB III. BAHAN DAN METODE
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan dalam dua tahap, yaitu pengambilan sampel yang dilakukan di daerah Subang pada bulan Desember 2009 dan pengujian
laboratorium di Laboratorium Terpadu dan Laboratorium Imunologi Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner pada bulan Februari
2010.
3.2 Bahan dan Alat Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah serum darah ayam kampung sebanyak 291 sampel dari ayam yang berbeda dan diambil dengan
metode purposive, buffer substrat, kit ELISA BioCheck yang terdiri dari reagent konjugat, substrat, stop solution, washing solution, larutan kontrol positif, dan
larutan kontrol negatif. Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah micropipet, diluted chamber, microtipe, microplate, ELISA reader, freezer, dan
kontainer.
3.3 Metode ELISA ELISA indirect
Microplate dikeluarkan dari kertas pembungkus. Kemudian dilakukan pendataan dan pengisian 100 µ l sampel darah ayam ke dalam tiap sumur. Empat
sumur pada kolom pertama microplate dikosongkan dari serum untuk dijadikan sumur kontrol positif dan negatif. Kemudian sebanyak 100 µl kontrol negatif
ditambahkan ke dalam sumur A1 dan B1. Selanjutnya sebanyak 100 µ l kontrol positif ditambahkan ke dalam sumur C1 dan D1.
Microplate dicuci dengan menggunakan larutan pencuci washing solution sebanyak 350 µ l dan dilakukan aspirasi minimal 4 kali sampai menyentuh dinding
sumur. Kemudian cairan pencuci tersebut dibuang dan microplate di telungkupkan pada kain yang berdaya serap tinggi sampai sumur benar-benar
kosong. Pencucian dilakukan sampai 4 kali dengan prosedur dan ketentuan yang sama. Setelah itu, sebanyak 100 µ l reagent konjugat ditambahkan ke dalam tiap
sumur dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 22 sampai 27 °C. Kemudian dilakukan kembali langkah dan prosedur pencucian.
Sebanyak 100 µ l substrat ditambahkan ke dalam tiap sumur. Kemudian microplate ditutup dengan alumunium foil. Setelah itu, microplate diinkubasi
pada suhu ruangan 22 sampai 27 °C selama 15 menit. Saat penambahan substrat sebaiknya dilakukan dalam kondisi intensitas cahaya yang rendah atau matikan
lampu ruangan. Hal ini dikarenakan substrat sangat reaktif terhadap cahaya. Setelah 15 menit berlalu, dilakukan penambahan 100 µ l stop solution untuk
menghentikan reaksi. Kemudian dilakukan pembacaan dengan menggunakan ELISA reader pada panjang gelombang 405 nm.
3.4 Pembacaan Hasil Hasil yang valid ditunjukkan dengan nilai absorban kontrol negatif harus
terbaca di bawah 0.30 dan perbedaan nilai rata-rata negatif kontrol dengan positif kontrol lebih besar dari pada 0.15.
3.5 Interpretasi Hasil
Kategori