air mendidih dan dengan air sebanyak 3 kali. Residu dekstruksi kembali dengan 100 ml NaOH 1,25 selama 30 menit. Lalu disaring dengan cara sama seperti
di atas dan dibilas berturut-turut dengan 25 ml H
2
SO
4
1,25 mendidih, 2,5 ml air sebanyak tiga kali dan 25 ml alkohol. Residu beserta kertas saring dipindahkan
ke cawan porselin dan porselin ditimbang A, lalu dimasukkan dalam tanur 600
o
C selama 30 menit, didinginkan dan ditimbang kembali B. Kadar serat kasar dapat dihitung dengan perumusan sebagai berikut:
Keterangan: W
= bobot residu sebelum dibakar dalam tanur = A – bobot kertas saring + cawan
Wo = B – bobot cawan
A = bobot residu + kertas saring + cawan
B = bobot residu + cawan
3.3.3 Analisis antioksidan 1 Ekstraksi bahan aktif Quinn 1988 diacu dalam Darusman
et al. 1995
Analisis yang dilakukan terhadap ekstrak kasar menggunakan dua uji, yaitu uji aktivitas antioksidan metode DPPH untuk mengetahui aktivitas
antioksidan dari
ekstrak masing-masing
pelarut dan
uji fitokimia
untuk menentukan senyawa kimia yang terdapat dalam kangkung air. Tahapan analisis antioksidan terdiri atas beberapa langkah, yaitu persiapan
sampel dan ekstraksi bahan aktif. Pada tahap persiapan sampel, bagian kangkung air daun, tangkai daun dan batang yang telah diambil segera dikeringkan
dengan panas matahari selama 3 hari. Bagian
kangkung air
yang telah
kering kemudian
dihaluskan dengan blender, sehingga diperoleh serbuk halus. Ukuran sampel yang kecil
serbuk halus diharapkan dapat memperluas permukaan bahan yang kontak langsung dengan pelarut, sehingga proses ekstraksi komponen bioaktif
dapat berjalan dengan maksimal.
Langkah selanjutnya adalah ekstraksi bahan aktif. Metode ekstraksi yang digunakan adalah metode Quinn 1988 diacu dalam Darusman et al. 1995 yang
telah dimodifikasi oleh Khusniya 2004. Pada metode ini digunakan tiga macam pelarut berdasarkan tingkat kepolarannya, yaitu kloroform non polar, etil asetat
semi polar dan metanol polar. Sampel sebanyak 25 g yang telah dihancurkan, dimaserasi dengan pelarut
kloroform sebanyak 100 ml selama 48 jam dengan diberi goyangan menggunakan orbital shaker dengan kecepatan 8 rpm. Hasil maserasi yang berupa larutan
kemudian disaring dengan kertas saring Whatman 42 sehingga diperoleh filtrat dan residu. Residu yang dihasilkan selanjutnya dimaserasi dengan etil asetat
sebanyak 100 ml selama 48 jam dengan diberi goyangan yang sama dengan maserasi sebelumnya, sedangkan filtrat yang diperoleh dievaporasi
menggunakan rotary vacuum evaporator pada suhu 50
o
C. Hasil proses maserasi ke-2 selanjutnya disaring dengan kertas saring
Whatman 42. Residu yang dihasilkan dilarutkan dengan metanol sebanyak 100 ml dan dimaserasi selama 48 jam dengan diberi goyangan menggunakan orbital
shaker dengan kecepatan 8 rpm. Filtrat kemudian dievaporasi menggunakan rotary vacuum evaporator pada suhu 50
o
C. Hasil maserasi ke-3 dengan pelarut metanol kemudian disaring dengan
kertas saring Whatman 42. Filtrat ekstrak metanol yang diperoleh dievaporasi menggunakan rotary vacuum evaporator pada suhu 50
o
C, sedangkan residu yang tersisa dibuang. Berdasarkan proses ini, diperoleh ekstrak pelarut kloroform,
ekstrak etil asetat dan ekstrak metanol. Hasil ekstrak yang diperoleh kemudian digunakan untuk uji fitokimia dan analisis aktivitas antioksidan. Adapun proses
ekstraksi bertingkat tersebut dapat dilihat pada Gambar 6.
2 Uji aktivitas antioksidan Blois 1958 diacu dalam Hanani et al. 2005
Aktivitas antioksidan ekstrak kasar kangkung air ditentukan dengan metode DPPH
seperti yang
dinyatakan oleh
Blois 1958
diacu dalam
Hanani et al. 2005. Ekstrak kasar kangkung air diuji dalam beberapa konsentrasi, yaitu 200, 400, 600 dan 800 ppm. Larutan DPPH yang digunakan
dibuat dengan melarutkan kristal DPPH dalam pelarut metanol dengan konsentrasi 1 mM yang dilakukan pada suhu rendah serta terlindung dari cahaya.
Antioksidan sintetik
BHT digunakan
sebagai pembanding
dibuat dengan konsentrasi 2, 4, 6 dan 8 ppm.
Perhitungan larutan stok dan proses pengencerannya dapat dilihat pada Lampiran 2.
Gambar 6 Diagram alir proses ekstraksi kangkung air Ipomoea aquatica
Sumber: Khusniya 2004
Larutan ekstrak dan antioksidan pembanding BHT yang telah dibuat, masing-masing sebanyak 4,5 ml direaksikan dengan 0,5 ml larutan DPPH 1 mM
dalam tabung reaksi dan diberi penanda label. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 30 menit, kemudian diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometri UV-Vis pada panjang gelombang 517 nm. Absorbansi larutan
blanko juga diukur untuk melakukan perhitungan persen inhibisi. Larutan blanko dibuat dengan mencampurkan 4,5 ml metanol dengan 0,5 ml larutan DPPH 1 mM
dalam tabung reaksi.
Aktivitas antioksidan masing-masing sampel ekstrak dan BHT dinyatakan dengan persentase penghambatan radikal bebas persen inhibisi yang dapat
dihitung dengan formulasi sebagai berikut:
Nilai konsentrasi sampel ekstrak kangkung air ataupun antioksidan pembanding BHT dan hambatan ekstrak persen inhibisi diplot masing-masing
pada sumbu x dan y pada persamaan regresi linear. Persamaan regresi linear yang diperoleh dalam bentuk persamaan: y = bx + a, digunakan untuk mencari nilai
IC
50
inhibitor concentration 50 masing-masing sampel, dengan menyatakan nilai y sebesar 50 dan nilai x sebagai IC
50
. Nilai IC
50
menyatakan konsentrasi larutan sampel yang dibutuhkan untuk mereduksi DPPH sebesar 50.
3.3.4 Uji fitokimia Harborne 1987
