40
BAB III METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Rancangan Penelitian
Penelitian ini adalah penelitian observasional analitik untuk melihat perbedaan ekspresi Bcl2 jaringan hiperplasia endometrium non atipik
simpleks dan kompleks dan dilakukan analisa komparatif.
3.2. Waktu dan Tempat penelitian
Tempat penelitian di lakukan di Departemen Obstetri dan Ginekologi Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara dan RSUP
H. Adam Malik Medan sedangkan pemeriksaan imunohistokimia dilakukan di Departemen Patologi Anatomi PA Universitas Sumatera Utara.
Penelitian ini dilakukan mulai September hingga Oktober 2014.
3.3. Populasi Penelitian
Adalah pasien dengan hiperplasia endometrium yang mendapat perlakuan biopsi endometrium dimana jaringan akan diperiksa dalam
bentuk blok parafin.
3.4 Sampel dan besar sampel
3.4.1 Sampel
Sampel penelitian ini adalah sebagian dari populasi.
Universitas Sumatera Utara
41
3.4.2 Besar sampel
Penentuan besar sampel dihitung dengan rumus uji hipotesis terhadap rerata 2 populasi:
n1 = n2 = 2 Zα + Zβ δ
2
= 2 1,96 +0,84 0,32
2
x1 – x2 0,27 n1 = n2 = 22 subyek
Besar sampel total adalah n1 + n2 = 44 subyek Dimana:
n1 = n2 = besar sampel Z
α
= nilai baku normal dari tabel Z yang besarnya bergantung pada nilai α yang ditentukan. Nilai α = 0,05 Z
α
=1,96 Z
β
= nilai baku normal dari tabel Z yang besarnya bergantung pada nilai β yang ditentukan. Nilai β = 0,20 Z
β
=0,84 δ
= Standar deviasi = 0,32
4
x1 – x2 = selisih rerata yang dianggap bermakna yang ditetapkan sebesar 0,27
38
3.5 Identifikasi variabel Variabel Bebas
• Ekspresi Bcl-2 Variabel Tergantung
• Hiperplasia endometrium non atipik simpleks dan kompleks
Universitas Sumatera Utara
42
3.6. Cara kerja dan teknik pengumpulan data
Subyek penelitian diambil dari preparat blok parafin hiperplasia endometrium non atipik simpleks dan kompleks di Laboratorium Patologi
Anatomi RS.HAM dan FK.USU Medan
1. Setelah mendapat persetujuan dari komisi etik untuk melakukan penelitian, penelitian dimulai dengan mengumpulkan data dari
histopatologi pasien yang pernah diperiksa histopatologis dan didiagnosa hiperplasia endometrium non atipik.
2. Dari data PA tersebut, diambil data rekam medik tentang identitas lengkap dan karakteristik pasien.
3. Dilakukan peminjaman sediaan parafin blok. 4. Blok parafin dipotong dengan microtome, ketebalan 4 μ kemudian
difiksasi diatas objek glass. 5. Kemudian dilakukan deparafinisasi slide
6. Rehidrasi dilanjutkan dengan pencucian dengan air mengalir. Masukkan slide ke dalam PT Link Dako Epitope Retrieval: set up
Preheat 65 C, Running time 98
C selama 15 menit. 7. Pan pen. Segera masukkan dalam Tris Buffered Saline TBS pH
7,4. 8. Blocking dengan peroksidase block.
9. Cuci dalam Tris Buffered Saline TBS pH 7,4 10. Blocking dengan Normal horse Serum NHS 3.
11. Cuci dalam Tris Buffered Saline TBS pH 7,4
Universitas Sumatera Utara
43 12. Inkubasi dengan antibodi primer monoclonal mouse anti-body Bcl-
2 oncoprotein khusus, Clone 100D5 Leica Biosystems Newcastle, United Kingdom.
13. Cuci dalam Tris Buffered Saline TBS pH 7,4 14. Dako Real Envision Rabbit.
15. Cuci dalam Tris Buffered Saline TBS pH 7,4 16. DAB+substrat Chromogen solution dengan pengenceran 20uL
DAB: 1000 uL substrat tahan 5 hari di suhu 2-8
o
C setelah di mix. 17. Cuci dengan air mengalir.
18. Counterstain dengan hematoxylin 19. Cuci dengan air mengalir
20. Lithium carbonat 5 dalam aqua. 21. Cuci dengan air mengalir.
22. Dehidrasi Alk 80, Alk 96, Alk Abs. 23. Clearing xylol 1 xylol 2, xylol 3
24. Mounting + cover glass 25. Dilakukan interpretasi sediaan tersebut oleh dua orang ahli Patologi
Anatomi, dilakukan penilaian dengan uji kappa. 26. Hasil interprestasi sediaan tersebut dilakukan analisa statistik.
Universitas Sumatera Utara
44
3.7. Definisi Operasional
Kategori