20
3.5 Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel dilakukan secara purposif, yaitu ditentukan atas dasar pertimbangan bahwa sampel yang terambil mempunyai karakteristik yang sama
dengan yang diteliti Sudjana, 2005. Sampel yang digunakan yaitu krim X dan krim Y yang tiap gram mengandung kloramfenikol 20 mg dan prednisolon
2,5 mg.
3.6 Prosedur Penelitian 3.6.1 Pembuatan Larutan Induk Baku dan Larutan Standar
3.6.1.1 Pembuatan Larutan Induk Baku Kloramfenikol
Ditimbang dengan seksama 50 mg baku pembanding kloramfenikol kemudian dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 mL, ditambahkan 10 mL
dengan etanol absolut hingga larut, dicukupkan volume dengan etanol absolut sampai garis tanda sehingga didapatkan larutan dengan konsentrasi 1000
μgmL LIB I. Dari larutan LIB I dipipet 5 mL dimasukkan ke dalam labu tentukur
50 mL, dicukupkan dengan etanol absolut sampai garis tanda sehingga didapatkan laru
tan dengan konsentrasi 100 μgmL LIB II. Bagan alir prosedur penelitian dapat dilihat pada Lampiran 4 halaman 51.
3.6.1.2 Pembuatan Larutan Induk Baku Prednisolon
Dibuat larutan induk prednisolon dengan melarutkan 50 mg serbuk prednisolon BPFI dalam labu tentukur 50 mL, ditambahkan 10 mL dengan etanol
absolut hingga larut, dicukupkan volume dengan etanol absolut sampai garis tanda sehingga didapatkan larutan dengan konsentrasi 1000
μgmL LIB I. Dari larutan LIB I dipipet 5 mL dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 mL,
Universitas Sumatera Utara
21 dicukupkan dengan etanol absolut sampai garis tanda sehingga didapatkan larutan
dengan konsentrasi 100 μgmL LIB II. Bagan alir prosedur penelitian dapat dilihat pada Lampiran 4 halaman 52.
3.6.1.3 Pembuatan Larutan Standar Kloramfenikol
Larutan standar dibuat dalam 5 labu tentukur 25 mL yang memiliki konsentrasi masing-masing 12
μgmL, 14 μgmL, 16 μgmL, 18 μgmL, dan 20
μgmL, dengan cara mengencerkan sebanyak 3,0 mL; 3,5 mL; 4,0 mL; 4,5 mL; dan 5,0 mL secara berurutan dari LIB II kloramfenikol menggunakan pelarut
etanol absolut. Bagan alir prosedur penelitian dapat dilihat pada Lampiran 4 halaman 51.
3.6.1.4 Pembuatan Larutan Standar Prednisolon
Diambil sebanyak 2,0 mL; 2,5 mL; 3,0 mL; 3,5 mL; dan 4,0 mL dari LIB II prednisolon. Kemudian masing-masing dimasukkan ke dalam 5 labu
tentukur 25 mL. Dilarutkan dengan pelarut etanol absolut. Kemudian dicukupkan dengan pelarut yang sama untuk membuat larutan standar dengan konsentrasi
8 μgml; 10 µgmL, 12 μgmL; 14 µgmL; dan 16 μgmL. Bagan alir prosedur
penelitian dapat dilihat pada Lampiran 4 halaman 52.
3.6.1.5 Pembuatan Larutan Baku Prednisolon untuk Adisi
Ditimbang baku prednisolon 10 mg, kemudian dimasukkan ke dalam labu tentukur 200 mL, ditambahkan etanol sebanyak 20 mL, disonikasi selama 10
menit hingga larut, ditambahkan etanol absolut sampai tanda.
Universitas Sumatera Utara
22
3.6.2 Pembuatan Spektrum Serapan Maksimum 3.6.2.1 Pembuatan Spektrum Serapan Maksimum Kloramfenikol
Diambil sebanyak 3,5 mL dari LIB II kloramfenikol konsentrasi = 100
μgmL kemudian dimasukan ke dalam labu tentukur 25 mL untuk kemudian dilarutkan dengan etanol absolut. Selanjutnya larutan diencerkan dengan pelarut
yang sama hingga garis tanda, lalu dikocok sampai homogen untuk memperoleh larutan kloramfenikol dengan konsentrasi 14
μgmL. Diukur serapannya pada panjang gelombang 200-400 nm. Bagan alir prosedur penelitian dapat dilihat pada
Lampiran 4 halaman 51.
3.6.2.2 Pembuatan Spektrum Serapan Maksimum Prednisolon
Diambil sebanyak 3,0 mL dari LIB II prednisolon konsentrasi = 100
μgmL kemudian dimasukan ke dalam labu tentukur 25 mL untuk diencerkan dengan pelarut etanol absolut hingga garis tanda, lalu dikocok sampai
homogen untuk memperoleh larutan dengan konsentrasi 12 μgmL. Diukur
serapannya pada panjang gelombang 200-400 nm. Bagan alir prosedur penelitian dapat dilihat pada Lampiran 4 halaman 52.
3.6.3 Pembuatan Spektrum Serapan Derivatif 3.6.3.1 Pembuatan Spektrum Serapan Derivatif Kloramfenikol
Spektrum serapan tanpa diderivatkan dari larutan standar kloramfenikol dengan konsentrasi 12
μgmL, 14 μgmL, 16 μgmL, 18 μgmL, dan 20 μgmL pada panjang gelombang 200-400 nm. Kemudian spektrum ditransformasikan
menjadi spektrum serapan derivat pertama dan kedua dengan Δλ = 2 nm. Bagan
alir prosedur penelitian dapat dilihat pada Lampiran 4 halaman 53.
Universitas Sumatera Utara
23
3.6.3.2 Pembuatan Spektrum Serapan Derivatif Prednisolon
Spektrum serapan tanpa diderivatkan dari larutan standar Prednisolon dengan konsentrasi 8
μgmL; 10 μgmL; 12 μgmL; 14 μgmL; dan 16 μgmL pada panjang gelombang 200 – 400 nm. Kemudian spektrum ditransformasikan
menjadi spektrum serapan derivat pertama dan kedua dengan Δλ = 2 nm. Bagan
alir prosedur penelitian dapat dilihat pada Lampiran 4 halaman 54.
3.6.4 Penentuan Zero Crossing
Penentuan zero crossing diperoleh dengan menumpangtindihkan spektrum serapan masing-masing derivat dalam berbagai konsentrasi larutan. Zero crossing
masing-masing zat ditunjukkan oleh panjang gelombang yang memiliki serapan nol pada berbagai konsentrasi.
3.6.5 Penentuan Panjang Gelombang Analisis
Larutan kloramfenikol dengan konsentrasi 16 μgmL, larutan prednisolon
dengan konsentrasi 8 μgmL, dan larutan campuran kloramfenikol 16 μgmL dan
prednisolon 8 μgmL. Kemudian ketiga larutan ini diukur serapannya pada
panjang gelombang 200 – 400 nm.Selanjutnya ditransformasikan menjadi spektrum serapan derivat pertama dan kedua dari masing-masing zat tunggal dan
dari campuran kloramfenikol dan prednisolon. Spektrum serapan derivat kedua dari larutan zat tunggal dan campuran keduanya ditumpangtindihkan. Yang dipilih
untuk menjadi panjang gelombang analisis adalah yang pada panjang gelombang tertentu, serapan tunggal salah satu senyawa nol sedangkan serapan tunggal
senyawa pasangannya dan campuran keduanya hampir sama atau persis sama. Karena pada panjang gelombang tersebut dapat secara selektif mengukur serapan
salah satu senyawa tanpa diganggu oleh serapan senyawa pasangannya.
Universitas Sumatera Utara
24
3.6.6 Pembuatan dan Penentuan Linearitas Kurva Kalibrasi 3.6.6.1 Pembuatan dan Penentuan Linearitas Kurva Kalibrasi Kloramfenikol
Larutan standar kloramfenikol dengan konsentrasi 12 μgmL; 14 μgmL;
16 μgmL; 18 μgmL; dan 20 μgmL, kemudian diukur serapan derivat kedua
Δλ = 2 nm pada panjang gelombang analisis yang telah ditentukan. Kemudian dilakukan analisis hubungan antara konsentrasi dan nilai serapan sehingga
diperoleh persamaan regresi linear y = ax + b, dan berdasarkan nilai serapan pada panjang gelombang analisis, dilakukan pula perhitungan LOD dan LOQ
digunakan rumus :
Keterangan : SB = simpangan baku
LOD = limit of Detection LOQ = limit of Quantitation
3.6.6.2 Pembuatan dan Penentuan Linearitas Kurva Kalibrasi Prednisolon
Larutan standar Prednisolon dengan konsentrasi 8 μgmL; 10 μgmL;
12 μgmL; 14 μgmL dan 16 μgmL, kemudian diukur serapan derivat kedua
Δλ = 2 nm pada panjang gelombang analisis yang telah ditentukan. Kemudian dilakukan analisis hubungan antara konsentrasi dan nilai serapan sehingga
diperoleh persamaan regresi linear y = ax + b, dan berdasarkan nilai serapan pada panjang gelombang analisis, dilakukan perhitungan LOD dan LOQ.
Universitas Sumatera Utara
25
3.6.7 Penentuan Kadar Kloramfenikol dan Prednisolon dalam Sediaan Krim
Ditimbang 10 tube krim X yang mengandung kloramfenikol 20 mg dan prednisolon 2,5 mg kemudian dikeluarkan isinya satu per satu dari dalam tube,
kemudian di masukkan ke dalam beker glass. Selanjutnya ditimbang seksama sejumlah krim setara dengan 20 mg kloramfenikol, dihitung kesetaraan
kloramfenikol yang terkandung di dalamnya penimbangan krim X dilakukan sebanyak enam kali pengulangan. Selanjutnya dimasukkan ke dalam labu
tentukur 50 mL, dan ditambahkan etanol absolut 10 mL, disonikasi selama 15 menit, sampai krimnya larut, kemudian dicukupkan dengan etanol absolut sampai
garis tanda, dikocok sampai homogen. Larutan tersebut kemudian disaring, lebih kurang 10 mL filtrat pertama dibuang. Filtrat selanjutnya ditampung. Kemudian
dari filtrat ini dipipet sebanyak 2,0 mL, ditambahkan 6 mL larutan prednisolon untuk adisi, dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 mL, dicukupkan dengan
etanol absolut sampai garis tanda sehingga diperoleh larutan yang didalamnya terdapat kloramfenikol konsentrasi 16
μgmL dan prednisolon konsentrasi 8
μgmL. Diukur serapan pada panjang gelombang 200 − 400 nm, selanjutnya spektrum serapan ditransformasikan menjadi spektrum serapan derivat kedua
den gan Δλ = 2 nm pada panjang gelombang analisis kloramfenikol dan
prednisolon masing-masing 227,60 nm dan 292,80 nm. Bagan alir prosedur penelitian penentuan kadar kloramfenikol dan prednisolon dapat dilihat pada
lampiran 4 halaman 55.
Universitas Sumatera Utara
26
3.6.8 Analisis Data Penetapan Kadar Secara Statistik
Data perhitungan kadar kloramfenikol dan prednisolon dianalisis secara statistik dengan menggunakan uji t tabel dapat dilihat pada Lampiran 26 halaman
112. Rumus yang digunakan adalah :
SD =
1 -
n X
- Xi
2
∑
Untuk mencari t hitung digunakan rumus:
t
hitung
= n
SD X
Xi −
Data diterima jika t
hitung
t
tabel
pada interval kepercayaan 95 dengan nilai α = 0,05.
Keterangan : SD = standard deviation simpangan baku
Xi = kadar dalam satu perlakuan
−
X
= kadar rata-rata dalam satu sampel n
= jumlah perlakuan α
= tingkat kepercayaan Menurut Sudjana 2005, Untuk menghitung kadar kloramfenikol dan
prednisolon sebenarnya dalam sampel secara statistik dapat digunakan rumus : µ =
X
± t α2, dk x SD √n
Universitas Sumatera Utara
27 Keterangan : SD
= standard deviation simpangan baku
−
X
= kadar rata-rata dalam satu sampel n
= jumlah perlakuan t
= harga t
tabel
sesuai dengan derajat kepercayaan
3.6.9 Uji Validasi 3.6.9.1 Uji Akurasi
3.6.9.1.1. Pembuatan Larutan Baku Induk Kloramfenikol
Ditimbang seksama ± 60 mg Baku Pembanding Kloramfenikol BPFI, dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml. Selanjutnya dilarutkan dan diencerkan
dengan etanol absolut sampai tanda Konsentrasi 1,2 mgml.
3.6.9.1.2. Pembuatan Larutan Baku Induk Prednisolon
Ditimbang seksama ± 15 mg Baku Pembanding Prednisolon BPFI, dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 ml. Selanjutnya dilarutkan dan
diencerkan dengan etanol absolut sampai tanda Konsentrasi. 0,15 mgml. 3.6.9.1.3. Pembuatan Larutan Uji
Konsentrasi 80 terdiri dari : 70 zat uji dan 30 baku : 80 x 20 mg = 16 mg
Penimbangan zat uji: x 16 mg = 11,2 mg,
penambahan baku: baku kloramfenikol:
x 16 mg = 4,8 mg ~ 4 ml larutan baku induk baku prednisolon: = 0,6 mg ~ 4 ml larutan baku induk
mg mg
mgx 20
16 5
, 2
100 30
Universitas Sumatera Utara
28 Konsentrasi 100 terdiri dari : 70 zat uji dan 30 baku :
100 x 20 mg = 20 mg Penimbangan zat uji:
x 20 mg = 16 mg, penambahan baku:
baku kloramfenikol: x 20 mg = 6 mg ~ 5 ml larutan baku induk
baku prednisolon: = 0,75 mg ~ 5 ml larutan baku induk
Konsentrasi 120 terdiri dari : 70 zat uji dan 30 baku : 120 x 20 mg = 24 mg
Penimbangan zat uji: x 24 mg = 16,8 mg,
penambahan baku: baku kloramfenikol:
x 24 mg = 7,2 mg ~ 6 ml larutan baku induk baku prednisolon: = 0,9 mg ~ 6 ml larutan baku induk
Selanjutnya masing-masing konsentrasi analit
80,100,120 dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 mL, dan ditambahkan etanol absolut 10
mL, disonikasi selama 15 menit, sampai krimnya larut, kemudian dicukupkan dengan etanol absolut sampai garis tanda, dikocok sampai homogen. Larutan
tersebut kemudian disaring, lebih kurang 10 mL filtrat pertama dibuang. Filtrat selanjutnya ditampung. Kemudian dari filtrat ini dipipet sebanyak 2,0 mL,
ditambahkan 6 mL larutan prednisolon untuk adisi, dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 mL, dicukupkan dengan etanol absolut sampai garis tanda. Masing-
mg mg
mgx 20
20 5
, 2
100 30
mg mg
mgx 20
24 5
, 2
100 30
Universitas Sumatera Utara
29 masing konsentrasi analit sampel dengan rentang spesifik 80, 100, 120,
dilakukan sebanyak tiga kali pengulangan. Kemudian campuran sampel dan baku diukur serapannya pada panjang gelombang 200 – 400 nm, selanjutnya spektrum
serapan ditransformasikan menjadi spektrum serapan derivat kedua dengan Δλ 2
nm pada panjang gelombang analisis kloramfenikol dan prednisolon masing- masing 227,6 nm dan 292,8 nm. Persen perolehan kembali dapat dihitung
dengan rumus: perolehan kembali =
100 Keterangan: C
F
= konsentrasi sampel setelah penambahan bahan baku C
A
= konsentrasi sampel sebelum penambahan bahan baku C
A
= Jumlah baku yang ditambahkan
3.6.9.2 Uji Presisi
Presisi diukur sebagai simpangan baku relatif atau koefisien variasi. Presisi merupakan ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji
individual ketika suatu metode dilakukan secara berulang untuk sampel yang homogen. Nilai simpangan baku relatif yang memenuhi persyaratan menunjukkan
adanya keseksamaan metode yang dilakukan Harmita, 2004. Simpangan baku relatif dapat dihitung dengan rumus berikut ini :
RSD = Keterangan: = kadar rata-rata sampel
SD = standard deviation RSD = relative standar deviation
Universitas Sumatera Utara
30
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Penentuan Spektrum Serapan Maksimum