BAB 3
METODOLOGI PENELITIAN
3.1. Alat-Alat
1. Kolom Kromatografi
2932 GL 14
2. Neraca analitis
Mettler PM 480 3.
Kertas saring biasa 4.
Rotary evaporator Buchi R-114
5. Labu rotarievaporator
500 ml Duran
6. Alat destilasi
7. Corong saring
8. Plat tetes
9. Indikator Universal
E. Merck Art 10.
Corong pisah 500 ml
Pyrex 11.
Gelas ukur 25 ml
Pyrex 50 ml
Pyrex 12.
Gelas beaker 500 ml
Pyrex 250 ml
Duran 13.
Gelas erlenmeyer 250 ml
Pyrex 14.
Pipa kapiler 15.
Pipet tetes 16.
Tabung reaksi Pyrex
17. Penangas air
18. Spatula
19. Melting point apparatus
Fisher Johns 20.
Botol vial 21.
Batang pengaduk
22. Magnetik stirer
23. Bejana KLT
24. Lampu UV
254 nm 25.
Hotplate stirrer PMC
26. Spektrofotometer IR
Shimadzu 27.
Spektrometer
1
H-NMR Delta2_NMR
3.2. Bahan
1. Daun tumbuhan sambiloto Andrographis paniculata Burm.f. Ness
2. Kloroform
3. Metanol
4. Ammonium hidroksida pekat
5. Asam asetat 2
6. Kieselgel 60 F
254
E.Merck.Art 554 7.
N-heksana 8.
Pereaksi Meyer 9.
Pereaksi Wagner 10.
Pereaksi Bouchardat 11.
Pereaksi Dragendorff 12.
Akuades 13.
Silika gel 60 GF 0,063-0,200 mm E.Merck. KGaA
3.3. Prosedur Penelitian
3.3.1. Penyediaan Sampel
Sampel yang diteliti adalah 1050 gram daun tumbuhan sambiloto Andrographis
paniculata Burm.f. Ness yang diperoleh dari areal pertanaman Fakultas Farmasi
Universitas Sumatera Utara.
3.3.2. Uji Skrining Fitokimia
Dilakukan uji pendahuluan terhadap daun tumbuhan sambiloto Andrographis paniculata
Burm.f. Ness untuk membuktikan adanya senyawa alkaloida yang terdapat di
dalamnya. Uji pendahuluan secara kualitatif dengan reaksi warna.
Prosedur : -
Dimasukkan 10 gram daun tumbuhan sambiloto Andrographis paniculata
Burm.f. Ness yang telah dikeringkan dan dipotong-potong kecil ke dalam
erlenmeyer -
Ditambahkan metanol secukupnya -
Didiamkan selama 1 malam -
Disaring -
Dibagi ekstrak metanol ke dalam 4 tabung reaksi -
Ditambahkan masing-masing pereaksi a.
Tabung I : dengan pereaksi Meyer menghasilkan larutan berwarna
kekeruhan b.
Tabung II : dengan pereaksi Wagner menghasilkan endapan berwarna
cokelat c.
Tabung III : dengan pereaksi Bouchardat menghasilkan endapan berwarna cokelat
d. Tabung IV : dengan pereksi Daragendorf menghasilkan endapan berwarna
merah kecokelatan
3.3.3. Pengadaan Ekstrak Kloroform Daun Tumbuhan Sambiloto
Daun tumbuhan sambiloto yang telah dikeringkan dan dipotong-potong kecil ditimbang sebanyak 1050 gram, kemudian dimaserasi dengan metanol sebanyak 7 liter selama ± 48
jam, kemudian disaring dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator sehingga terbentuk ekstrak pekat metanol. Ekstrak pekat metanol tersebut dipartisi
berulang-ulang dengan menggunakan n-heksan sebanyak 10 kali. Lalu diambil lapisan metanol dan dipekatkan. Kemudian diasamkan dengan menggunakan asam asetat 2
hingga mencapai pH=4 sambil diaduk. Lalu didiamkan selama 1 malam, kemudian dibasakan dengan NH
4
OH
p
sampai pH=10 sambil diaduk dan didiamkan selama 1 malam. Lalu diekstraksi partisi dengan menggunakan kloroform sebanyak 3 kali, lapisan
kloroform ditampung kemudian dipekatkan dengan menggunakan rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat kloroform sebagai alkaloida total sebanyak 0,537 gram.
3.3.4. Analisis Kromatografi Lapis Tipis
Analisis dimaksudkan untuk mencari perbandingan pelarut yang sesuai di dalam pemisahan senyawa dengan meningkatkan kepolarannya dalam kromatografi kolom.
Pelarut yang digunakan adalah campuran pelarut kloroform : metanol 9:1 ; 8:2 ; 7:3 ; 6:4 ; 5:5 ; 4:6 ; 3:7 ; 2:8 ; 1:9 vv, sehingga diperoleh perbandingan pelarut kloroform :
metanol yang sesuai untuk kromatografi kolom.
Pelarut yang sesuai didasarkan kepada jumlah bercak atau noda yang terpisah dengan baik dalam kromatografi lapis tipis.
Prosedur: Ke dalam bejana kromatografi lapis tipis dimasukkan larutan fase gerak yaitu
campuran pelarut kloroform : metanol dengan campuran pelarut 9:1 ; 8:2 ; 7:3 ; 6:4 ; 5:5 ; 4:6 ; 3:7 ; 2:8 ; 1:9 vv. Kemudian ekstrak kloroform ditotolkan pada plat KLT yang
sudah diaktifkan. Lalu plat dimasukkan ke dalam bejana yang berisi pelarut yang dijenuhkan, kemudian ditutup. Setelah dielusi, dikeluarkan dari bejana dan dikeringkan.
Noda yang terbentuk diamati dengan sinar ultraviolet dan difraksinasi dengan pereaksi bouchardat. Kemudian dihitung dan dicatat harga Rf. Yang memberikan pemisahan
bercak noda yang baik adalah perbandingan pelarut kloroform : metanol 9:1 vv yang memberikan tiga noda dengan harga Rf yaitu: 0,875 ; 0,625 ; 0,325.
3.3.5. Isolasi Senyawa Alkaloida dengan Kromatografi Kolom
Dilakukan isolasi senyawa alkaloida terhadap total alkaloida yang telah diperoleh dengan menggunakan kromatografi kolom. Dimana sebagai fase diam yaitu silika gel 60 GF
0,063-0,200 mm E.Merck.Art.7734 dan fase gerak yaitu pelarut kloroform 100 dengan campuran pelarut kloroform : metanol 90 : 10 ; 80 : 20 ; 70 : 30 ; 60 : 40 ; 50 : 50
; 40 : 60 ; 30 : 70 ; 20 : 80 ; 10 : 90 vv.
Prosedur : Dibersihkan peralatan kromatografi kolom, dibilas dengan metanol, dikeringkan,
dan dirangkai. Kemudian silika gel 60 GF 0,063-0,200 mm E.Merck.Art.7734 sebanyak 20 gram dibuburkan dengan pelarut n-heksana, diaduk sampai homogen dan dimasukkan
ke dalam kolom kromatografi. Lalu dielusi dengan n-heksana 100 hingga bubur silika gel memadat dan homogen. Dimasukkan alkaloida total sebanyak 0,537 gram yang telah
dibuburkan dengan silika gel ke dalam kolom kromatografi yang telah diaktifkan. Sampel dibiarkan turun hingga memadat. Kemudian dielusi dengan pelarut kloroform 100
sebanyak 100 ml dan diatur aliran fraksi yang keluar dari kolom kromatografi bergerak secara kontinu dan ditampung tiap fraksi dalam botolfial masing-masing sebanyak 8 ml.
Perlakuan yang sama dilakukan terhadap campuran pelarut antara kloroform : metanol 90 : 10 ; 80 : 20 ; 70 : 30 ; 60 : 40 ; 50 : 50 ; 40 : 60 ; 30 : 70 ; 20 : 80 ; 10 : 90
vv. Tiap-tiap fraksi yang telah diperoleh dari hasil elusi pelarut kloroform 100 dan variasi pelarut diKLT, lalu digabung fraksi dengan harga Rf yang sama dari perbandingan
pelarut kloroform : metanol 90 : 10 vv, kemudian diuapkan pelarutnya hingga diperoleh kristal.
3.3.6. Analisis Kristal Hasil Isolasi
3.3.6.1. Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis
Uji kemurnian kristal dilakukan dengan menggunakan kromatografi lapis tipis, dimana fase diam yang digunakan adalah Kieselgel 60 F
254
0,2 mm E.Merck.Art 554 dan fase gerak kloroform : metanol 90 : 10 vv.
Prosedur: Kristal yang diperoleh dilarutkan dengan metanol, lalu ditotolkan pada plat KLT.
1. Dimasukkan larutan fase gerak kloroform : metanol 90 : 10 vv dalam bejana
kromatografi lapis tipis yang telah dijenuhkan. Plat yang telah ditotolkan sampel dimasukkan ke dalam bejana kromatografi tersebut dan dibiarkan hingga pelarut
naik sampai batas atas yang telah ditentukan dalam plat tipis. 2.
Dikeluarkan plat dari bejana kromatografi, lalu dikeringkan dan dilihat bercak noda di bawah lampu UV, kemudian difiksasi dengan pereaksi bouchardat yang
memberikan bercak noda berwarna cokelat yang menunjukkan bahwa senyawa alkaloida positif.
3. Dikeringkan hingga terbentuk kristal. Dari kristal yang terbentuk tersebut
diperoleh 2 warna kristal dan hasil bercak noda dari KLT yang telah dilakukan diperoleh lebih dari satu bercak noda.
4. Dimurnikan dengan metanol sebanyak 3 kali, kemudian diuapkan hingga
terbentuk kristal.
Dilakukan uji kemurnian terhadap kristal yang sudah dimurnikan dengan menggunakan kromatografi lapis tipis, dengan cara :
- Dimasukkan larutan fase gerak kloroform : metanol 90 : 10 vv dalam bejana
kromatografi lapis tipis yang telah dijenuhkan. Plat yang telah ditotolkan sampel dimasukkan ke dalam bejana kromatografi tersebut dan dibiarkan hingga pelarut
naik sampai batas atas yang telah ditentukan dalam plat tipis.
- Dikeluarkan plat dari bejana kromatografi, lalu dikeringkan dan dilihat bercak
noda di bawah lampu UV, kemudian difiksasi dengan pereaksi bouchardat yang memberikan bercak noda tunggal berwarna cokelat yang menunjukkan bahwa
senyawa alkaloida positif.
3.3.6.2. Uji Reaksi Warna terhadap Kristal Hasil Isolasi dengan Pereaksi Alkaloida
Dilarutkan kristal hasil isolasi secukupnya ke dalam botolfial, lalu diteteskan menjadi 4 larutan ke dalam plat tetes.
1. Larutan pertama ditetesi dengan pereaksi Meyer memberikan larutan berwarna
kekeruhan 2.
Larutan kedua ditetesi dengan pereaksi Bouchardat memberikan endapan berwarna cokelat
3. Larutan ketiga ditetesi dengan pereaski Wagner memberikan endapan berwarna
cokelat 4.
Larutan ketiga ditetesi dengan pereaksi Dragendorf memberikan endapan berwarna putih kekuningan
3.3.6.3. Penentuan Titik Lebur
Kristal hasil isolasi yang telah murni dimasukkan ke dalam peralatan melting point apparatus, diatur temperaturnya, lalu diamati temperatur awal mulai kristal melebur
sampai kristal melebur seluruhnya.
3.3.7. Analisis Spektroskopi Kristal Hasil Isolasi
3.3.7.1. Uji Kristal Hasil Isolasi dengan Spektrofotometer Inframerah
Analisis kristal hasil isolasi dengan alat spektrofotometer FT-IR dilakukan di Pusat
Penelitian Kimia LIPI Serpong – Tangerang. lampiran E
3.3.7.2. Uji Kristal Hasil Isolasi dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton
1
H-NMR
Analisis Kristal hasil isolasi dengan alat Spektrometer
1
H-NMR dilakukan di Pusat Penelitian Kimia LIPI Serpong – Tangerang dengan menggunakan metanol CD
3
OD
sebagai pelarut. lampiran F-I
3.3. Bagan Tes Uji Pendahuluan Skrining Fitokimia terhadap Daun Tumbuhan Sambiloto
Diekstraksi maserasi dengan pelarut metanol Disaring
Dibagi dalam 4 tabung reaksi Ditambahkan
Ditambahkan Ditambahkan
Ditambahkan perekasi Meyer
pereaksi Wagner pereaksi Bouchardat pereaksi Dragendorf
Diamati perubahan Diamati perubahan Diamati perubahan Diamati peruba- yang terjadi
yang terjadi yang terjadi han yang terjadi 10 g daun tumbuhan
sambiloto kering halus
Ekstrak pekat metanol
Tabung I Tabung II
Tabung III Tabung IV
Larutan kekeruhan
Endapan coklat
Endapan coklat
Endapan merah kecoklatan
3.3.1. Bagan Penelitian
→ Disikrining fitokimia → Dimaserasi dengan metanol selama ± 48 jam
→ diulangi sebanyak 3 kali
→ diskrining fitokimia → dipekatkan dengan rotarievaporator
→ diekstraksi partisi dengan n-heksana sebanyak 10 kali
→ dipekatkan dengan rotarievaporator → diasamkan dengan CH
3
COOH 2 hingga pH=4 sambil diaduk → didiamkan 1 malam
→ disaring
→ dibasakan dengan NH
4
OH
p
hingga pH=10 sambil diaduk → didiamkan 1 malam
→ diekstrasi partisi dengan pelarut CHCl
3
sebanyak 3 kali
→ dipekatkan dengan rotarievaporator → uji pereaksi alkaloida
→ dianalisis KLT untuk menentukan eluen yang sesuai pada pemisahan kromatografi kolom → dipisahkan dengan kolom kromatografi dengan fase diam silika gel 60 GF 0,063-0,200 mm E.Merck. KGaA
dan fase gerak kloroform : metanol 90:10 vv → ditampung tiap fraksi sebanyak 8 ml
→ uji pereaksi alkaloida → uji pereaksi alkaloida → monitoring → monitoring KLT Rf → monitoring KLT Rf → monitoring KLT Rf → monitoring KLT Rf KLT Rf
→ diuapkan → diuapkan → diuapkan → diuapkan → dikristalisasi dengan
metanol → dianalisis KLT
→ dikarakterisasikan Ekstrak pekat metanol
Lapisan n-heksana Lapisan metanol
Ekstrak metanol-asam pH=4 1050 gram daun tumbuhan
sambiloto kering halus
Residu
Ekstrak basa pH=10
Lapisan CHCl
3
Ekstrak basa pH=10 Residu
Ekstak metanol
Ekstrak pekat CHCl
3
Fraksi 1-2 Fraksi 5-7
Residu kuning Fraksi 8-11
Kristal Fraksi 12-20
Residu cokelat kekuningan
Kristal murni Putih Kekuningan Hasil negatif
Fraksi 3-4
Residu cokelat kekuningan
Titik Lebur FT-IR
1
H-NMR
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Hasil Penelitian
Dari hasil uji pendahuluan skrining fitokimia yang dilakukan terhadap daun tumbuhan
sambiloto Andrographis paniculata Burm.f. Ness menunjukkan bahwa daun
tumbuhan sambiloto mengandung senyawa alkaloida. Dimana pereaksi-pereaksi yang digunakan menunjukkan:
1. Pereaksi Meyer menghasilkan larutan berwarna kekeruhan
2. Pereaksi Wagner menghasilkan endapan cokelat
3. Pereaksi Bouchardat menghasilkan endapan cokelat
4. Pereaksi Dragendorf menghasilkan endapan merah kecokelatan
Hasil isolasi senyawa alkaloida dari daun tumbuhan sambiloto Andrographis
paniculata Burm.f. Ness diperoleh dengan menggunakan fase gerak CHCl
3
: metanol 90:10 vv pada fraksi 8-11 berwarna putih kekuningan, berbentuk amorf dengan
TL=149-152
o
C.
Hasil analisis Spektrofotometer infra merah FT-IR dari kristal hasil isolasi memberikan pita-pita serapan pada daerah bilangan gelombang cm
-1
sebagai berikut lampiran E :
1. Pada bilangan gelombang 3433,29 – 3360 cm
-1
puncak lemahsedang menunjukkan adanya vibrasi ulur stretch basa nitrogen amina -N-.
2. Pada bilangan gelombang 2931,80 – 2852,72 cm
-1
puncak sedang menunjukkan adanya vibrasi ulur stretch –CH.
3. Pada bilangan gelombang 1747,51 cm-1 puncak kuat menunjukkan adanya vibrasi
ikatan rangkap C=O dari keton lakton.
4. Pada bilangan gelombang yang terdapat pada daerah 1643,35 cm
-1
puncak sedang menunjukkan adanya ikatan rangkap C=C dari system vinyl.
5. Pada bilangan gelombang 1610,56 cm
-1
puncak sedang diduga menunjukkan adanya absorbsi dari indolina kromofor Hesse, 1983.
6. Pada bilangan gelombang 1444,68 cm
-1
puncak kuat menunjukkan adanya vibrasi ulur stretch –CH
3
. 7.
Pada bilangan gelombang 1246,02 cm
-1
dan 1172,72 cm
-1
puncak sedang menunjukkan adanya vibrasi ulur stretch dari C-O.
8. Pada bilangan gelombang 1068,56 cm
-1
puncak sedang menunjukkan adanya vibrasi tekuk bend ikatan –NH.
9. Pada bilangan gelombang 1029,99 cm
-1
puncak kuat menunjukkan adanya vibrasi ulur stretch dari gugus –CN.
10. Pada bilangan gelombang 835,18 cm
-1
dan 785,03 cm
-1
puncak sedang menunjukkan adanya vibrasi –CH pada cincin aromatik.
11. Pada bilangan gelombang 686,66 cm
-1
puncak sedang menunjukkan adanya vibrasi ulur stretch –NH.
Hasil analisis spektrofotometer Resonansi Magnetik Inti Proton
1
H-NMR
memberikan pergeseran kimia pada daerah ppm sebagai berikut lampiran F-I :
1. Pergese
ran kimia pada daerah δ=0,71 – 2,0 ppm puncak beragam multiplet menunjukkan adanya proton-proton pada gugus –CH
3
, -CH
2
, -CH. Penampakan puncak tajam intense peak singlet jelas t
erlihat pada pergeseran kimia δ=0,71 ppm dan
δ=1,05 ppm. Kedua puncak tajam tersebut menunjukkan adanya gugus –CH
3
. 2.
Pergeser an kimia pada daerah δ=3,65 – 3,68 ppm puncak kuartet menunjukkan
proton pada subsitusi gugus etilidina. 3.
Pergeseran kimia pada daerah δ=3,83 – 3,86 ppm puncak doblet-doblet yang
menunjukkan proton yang terdapat pada sistem vinyl. 4.
Pergese ran kimia pada daerah δ=4,08 – 4,10 ppm puncak doblet dan δ=4,16 –
4,17 ppm puncak doblet menunjukkan proton yang terikat pada C
2
dan C
3
pada cincin 5 anggota struktur indolina alkaloida.
5. Per
geseran kimia pada daerah δ=4,63 ppm puncak singlet menunjukkan proton yang terikat pada gugus –NH stuktur indol atau indolina.
6. Pergeseran
kimia pada daerah δ=7,33 ppm puncak singlet menunjukkan proton- proton pada cincin benzena.
4.2. Pembahasan