3.3.3. Pengadaan Ekstrak Kloroform Daun Tumbuhan Sambiloto
Daun tumbuhan sambiloto yang telah dikeringkan dan dipotong-potong kecil ditimbang sebanyak 1050 gram, kemudian dimaserasi dengan metanol sebanyak 7 liter selama ± 48
jam, kemudian disaring dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator sehingga terbentuk ekstrak pekat metanol. Ekstrak pekat metanol tersebut dipartisi
berulang-ulang dengan menggunakan n-heksan sebanyak 10 kali. Lalu diambil lapisan metanol dan dipekatkan. Kemudian diasamkan dengan menggunakan asam asetat 2
hingga mencapai pH=4 sambil diaduk. Lalu didiamkan selama 1 malam, kemudian dibasakan dengan NH
4
OH
p
sampai pH=10 sambil diaduk dan didiamkan selama 1 malam. Lalu diekstraksi partisi dengan menggunakan kloroform sebanyak 3 kali, lapisan
kloroform ditampung kemudian dipekatkan dengan menggunakan rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat kloroform sebagai alkaloida total sebanyak 0,537 gram.
3.3.4. Analisis Kromatografi Lapis Tipis
Analisis dimaksudkan untuk mencari perbandingan pelarut yang sesuai di dalam pemisahan senyawa dengan meningkatkan kepolarannya dalam kromatografi kolom.
Pelarut yang digunakan adalah campuran pelarut kloroform : metanol 9:1 ; 8:2 ; 7:3 ; 6:4 ; 5:5 ; 4:6 ; 3:7 ; 2:8 ; 1:9 vv, sehingga diperoleh perbandingan pelarut kloroform :
metanol yang sesuai untuk kromatografi kolom.
Pelarut yang sesuai didasarkan kepada jumlah bercak atau noda yang terpisah dengan baik dalam kromatografi lapis tipis.
Prosedur: Ke dalam bejana kromatografi lapis tipis dimasukkan larutan fase gerak yaitu
campuran pelarut kloroform : metanol dengan campuran pelarut 9:1 ; 8:2 ; 7:3 ; 6:4 ; 5:5 ; 4:6 ; 3:7 ; 2:8 ; 1:9 vv. Kemudian ekstrak kloroform ditotolkan pada plat KLT yang
sudah diaktifkan. Lalu plat dimasukkan ke dalam bejana yang berisi pelarut yang dijenuhkan, kemudian ditutup. Setelah dielusi, dikeluarkan dari bejana dan dikeringkan.
Noda yang terbentuk diamati dengan sinar ultraviolet dan difraksinasi dengan pereaksi bouchardat. Kemudian dihitung dan dicatat harga Rf. Yang memberikan pemisahan
bercak noda yang baik adalah perbandingan pelarut kloroform : metanol 9:1 vv yang memberikan tiga noda dengan harga Rf yaitu: 0,875 ; 0,625 ; 0,325.
3.3.5. Isolasi Senyawa Alkaloida dengan Kromatografi Kolom
Dilakukan isolasi senyawa alkaloida terhadap total alkaloida yang telah diperoleh dengan menggunakan kromatografi kolom. Dimana sebagai fase diam yaitu silika gel 60 GF
0,063-0,200 mm E.Merck.Art.7734 dan fase gerak yaitu pelarut kloroform 100 dengan campuran pelarut kloroform : metanol 90 : 10 ; 80 : 20 ; 70 : 30 ; 60 : 40 ; 50 : 50
; 40 : 60 ; 30 : 70 ; 20 : 80 ; 10 : 90 vv.
Prosedur : Dibersihkan peralatan kromatografi kolom, dibilas dengan metanol, dikeringkan,
dan dirangkai. Kemudian silika gel 60 GF 0,063-0,200 mm E.Merck.Art.7734 sebanyak 20 gram dibuburkan dengan pelarut n-heksana, diaduk sampai homogen dan dimasukkan
ke dalam kolom kromatografi. Lalu dielusi dengan n-heksana 100 hingga bubur silika gel memadat dan homogen. Dimasukkan alkaloida total sebanyak 0,537 gram yang telah
dibuburkan dengan silika gel ke dalam kolom kromatografi yang telah diaktifkan. Sampel dibiarkan turun hingga memadat. Kemudian dielusi dengan pelarut kloroform 100
sebanyak 100 ml dan diatur aliran fraksi yang keluar dari kolom kromatografi bergerak secara kontinu dan ditampung tiap fraksi dalam botolfial masing-masing sebanyak 8 ml.
Perlakuan yang sama dilakukan terhadap campuran pelarut antara kloroform : metanol 90 : 10 ; 80 : 20 ; 70 : 30 ; 60 : 40 ; 50 : 50 ; 40 : 60 ; 30 : 70 ; 20 : 80 ; 10 : 90
vv. Tiap-tiap fraksi yang telah diperoleh dari hasil elusi pelarut kloroform 100 dan variasi pelarut diKLT, lalu digabung fraksi dengan harga Rf yang sama dari perbandingan
pelarut kloroform : metanol 90 : 10 vv, kemudian diuapkan pelarutnya hingga diperoleh kristal.
3.3.6. Analisis Kristal Hasil Isolasi
Kategori