27
BAB III METODE PENELITIAN
3.1 Desain Penelitian
Penelitian bersifat deskriptif dengan menggunakan metode penelitian Cross Sectional.
3.2 Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif hidayatullah Jakarta, pada bulan Januari 2016
sampai dengan Juli 2016.
3.3 Populasi dan Sampel Penelitian 3.3.1 Populasi Penelitian
Penjual cilok yang berada di lingkungan Sekolah Dasar Negeri di kelurahan Cirendeu, Pisangan, dan Cempaka Putih.
3.3.2 Sampel Penelitian
Sampel berupa cilok yang diambil dari penjual cilok di lingkungan Sekolah Dasar Negeri di kelurahan Cirendeu, Pisangan, dan Cempaka Putih. Sampel cilok
terdiri dari: 1.
Sampel 1 : Cilok dengan saus tomat, kecap, sambal, dan bumbu penyedap rasa
2. Sampel 2 : Cilok dengan saus tomat, kecap, sambal, dan bumbu
penyedap rasa 3.
Sampel 3 : Cilok dengan saus kacang, sambal, dan kecap 4.
Sampel 4 : Cilok dengan saus tomat, kecap, sambal, dan bumbu penyedap rasa
5. Sampel 5 : Cilok dengan saus tomat, kecap, sambal, dan bumbu
penyedap rasa
3.4 Variabel Penelitian
Variable penelitian ini adalah cilok variable bebas dan Eschericia coli, Shigella sp. variable terikat.
3.5 Alat dan Bahan Penelitian 3.5.1 Alat Penelitian
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah gelas beker 250 mL, 500 mL dan 1000 mL, tabung erlenmeyer 500 mL, tabung
ukur 100 mL dan 10 mL, tabung reaksi, rak tabung reaksi, cawan petri, bunsen, spatula, pinset, pipet, ose, batang L, korek api, tip 1000
μL dan 100
μL, mikropipet 1000 μL dan 100 μL, blender, autoklaf, oven, inkubator, kulkas, laminar, vortex, timbangan, hot plate,magnetic stir, tisu,
kapas, handscoon, masker, minyak immerse, mikroskop, dan swab kapas kering.
3.5.2 Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah cilok, media NB, NA, SSA, dan EMB, larutan untuk pewarnaan Gram kristal karbol ungu,
lugol, alkohol 90, safranin, serbuk bom chresol, reagen KOH, reagen methyl red, dan reagen erlich atau kovac.
3.6. Cara Kerja Penelitian 3.6.1. Tahap Persiapan
3.6.1.1. Sterilisasi Alat dan Bahan
A. Sterilisasi basah
Bahan dan alat yang di sterilisasi dalam autoklaf yaitu media NA, EMB, dan akuades dalam tabung erlenmeyer, gula-gula, indol, MR-VP, sitrat, TSIA,
dan NB dalam tabung reaksi, dan tip. Media yang dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan tip terlebih dahulu dibungkus dengan plastik tahan panas, lalu
dimasukkan ke dalam autoklaf selama ± 1-2 jam.
B. Sterilisasi kering
Bahan dan alat yang di sterilisasi dalam oven seperti pinset, spatula dan cawan petri. Sebelum dimasukan ke dalam oven telah dibungkus dengan kertas.
Kemudian masukkan ke dalam oven ± 1 jam hingga mencapai suhu 150˚C.
3.6.1.2. Pengambilan dan Persiapan Sampel Sampel dibeli di penjual cilok di SD Negeri yang terdapat di kelurahan
Cirendeu, Pisangan, dan Cempaka Putih, sampel dibeli kisaran pukul 09.00-12.00 WIB. Jika tidak langsung digunakan sampel yang telah dibeli dimasukkan di
lemari es dengan suhu 3 C, sehingga kondisi sampel tidak mengalami perubahan.
Ketika sampel akan digunakan sebelumnya terlebih dahulu diblender sampai
halus dan encer, lalu ditimbang sebanyak 10 gram. 3.6.2. Pembuatan Media dan Penanaman Sampel
3.6.2.1. Pembuatan Media NB dan Pengenceran Media NB ditimbang sebanyak 4 gr, lalu dimasukkan ke dalam gelas
beker yang telah berisi akuades 306 mL, kemudian panaskan pada hotplate selama ± 15 menit, 15
0˚C. Setelah itu masukkan ke dalam tabung reaksi masing-masing 9 mL sebanyak 14 tabung dan masing-masing 90 mL pada 2 tabung erlenmeyer
250 mL dan tutup semua tabung dengan kapas. Masukkan seluruh tabung reaksi ke dalam plastik lalu sterilisasi bersama tabung erlenmeyer di autoklaf selama ±
1-2 jam, kemudian masukkan ke dalam kulkas bersuhu 3˚C.
Setelah media siap digunakan persiapkan sampel, yaitu dengan memblender sampel sampai halus dan tercampur, lalu sampel ditimbang dengan
ukuran 10 gram, kemudian disiapkan 7 tabung yang berisi masing-masing 9 mL NB dan media NB 90 mL dalam tabung erlenmeyer. Kemudian sampel sebanyak
10 gr dimasukkan ke dalam tabung erlenmeyer berisi 90 mL NA divortex sampai homogen, setelah homogen ambil 1 ml campuran NB dan sampel dengan
menggunakan menggunakan tip 1000 μL dan dimasukan pada tabung reaksi ke-1
dengan pengenceran 10
-1
. Dari tabung reaksi ke-1 yang telah berisi media NB 9 mL dan sampel 1 mL di vortex hingga homogen dan diambil 1 ml dengan
mengunakan tip 1000 μL dan dimasukan pada tabung ke-2, lalu di vortex hingga
homogen. Dilakukan hal yang sama pada tabung-tabung selanjutnya sampai dengan tabung ke-6. Pada tabung ke-7 isi dengan 9 mL NB tanpa sampel yang
nantinya digunakan sebagai kontrol negatif. 3.6.2.2. Pembuatan Media NA dan Penanaman Sampel
Media NA ditimbang sebanyak 8 gr, lalu dimasukkan ke dalam gelas beker yang telah berisi akuades 560 mL, kemudian panaskan pada hotplate selama
± 20 menit, 150˚C. Setelah itu masukkan ke dalam tabung erlenmeyer 500 mL dan tutup dengan kapas, kemudian sterilisasi di autoklaf selama ± 1-2 jam. Setelah itu,
tuang media ke dalam cawan petri masing-masing ± 20 mL dan dinginkan, bila telah mengeras masukkan ke
dalam kulkas bersuhu 3˚C. Setelah tahap pengenceran, ambil 0,1 mL dengan mikropipet diambil dari
tabung reaksi yang telah di vortex ulang dengan konsentari 10
-1
, 10
-2
, 10
-3
, 10
-4
, 10
-5
sesuai dengan koloni bakteri yang dihasilkan dan kontrol negatif. Ambil 0,1 mL dan diletakkan pada 2 cawan petri lalu diberikan label sesuai dengan
pengenceran, contoh: 1-1, 1-2 sampai dengan 4-1, 4-2. Pada kontrol negatif, teteskan 0,1 mL NB dari tabung reaksi ke 7 lalu diletakkan pada satu cawan petri
dan diberi label “kontrol”. Rendam batang L dalam larutan alkohol, lalu setiap akan digunakan keluarkan batang L dari larutan alkohol, kemudian dilewatkan
diatas api 1-2 kali, diamkan sebentar hingga sudah tidak panas kemudian goreskan batang L diatas media untuk meratakan larutan sampel yang telah diteteskan.
Kemudian inkubasi cawan selama 24 jam, lalu lakukan hitung jumlah koloni yang terbentuk.
3.6.2.3. Pembuatan Media EMB dan Penanaman Sampel Media EMB ditimbang sebanyak 1,5 gr, masukkan ke dalam gelas beker
yang telah berisi 40 mL akuades, lalu panaskan pada hotplate selama ± 20 menit, 150˚C. Kemudian masukkan ke dalam tabung erlenmeyer 250 mL dan tutup
dengan kapas. Setelah itu sterilisasi di autoklaf selama ± 1-2 jam, kemudian tuang media ke dalam cawan petri masing-masing ±20 mL dan dinginkan, bila telah
mengeras masukkan ke dalam kulkas bersuhu 3˚C.
Setelah tahap pengenceran dan penanaman larutan sampel pada media NA. Ambil 0,1 mL dengan menggunakan mikropipet pada tabung reaksi dengan
pengenceran 10
-1
, lalu diletakkan pada media EMB. Rendam batang L dalam larutan alkohol, lalu setiap akan digunakan keluarkan batang L dari larutan
alkohol, kemudian dilewatkan diatas api 1-2 kali, diamkan sebentar hingga sudah tidak panas kemudian goreskan batang L diatas media untuk meratakan larutan
sampel yang telah diteteskan. Kemudian cawan diinkubasi selama 24 jam, setelah itu amati koloni yang tumbuh yang selanjutnya dilakukan pewarnaan dan uji
biokimia. 3.6.2.4. Pembuatan Media SSA dan Penanaman Sampel
Masukkan akuades 40 mL ke dalam tabung erlenmeyer 250 mL dan tutup dengan kapas, lalu sterilisasi di autoklaf selama ± 1-2 jam. Timbang media SSA
sebanyak 2,4 gr, lalu masukkan media SSA ke dalam tabung erlenmeyer yang telah di sterilisasi, kemudian dipanaskan pada hotplate
selama ± 15 menit, 150˚C. setelah itu, tuang media ke dalam cawan petri masing-masing ±20 mL dan
dinginkan, bila telah mengeras masukkan ke dalam kulkas bersuhu 3˚C.
Setelah tahap pengenceran dan penanaman larutan sampel pada media NA. Ambil 0,1 mL dengan menggunakan mikropipet pada tabung reaksi dengan
pengenceran 10
-1
, lalu diletakkan pada SSA. Rendam batang L dalam larutan alkohol, lalu setiap akan digunakan keluarkan batang L dari larutan alkohol,
kemudian dilewatkan diatas api 1-2 kali, diamkan sebentar hingga sudah tidak panas kemudian goreskan batang L diatas media untuk meratakan larutan sampel
yang telah diteteskan. Kemudian cawan diinkubasi selama 24 jam, setelah itu amati koloni yang tumbuh yang selanjutnya dilakukan pewarnaan dan uji
biokimia. 3.6.2.5. Identifikasi Bakteri dengan Pewarnaan Gram
Bakteri yang telah tumbuh di media spesifik EMB Agar, dan SSA dilakukan pewarnaan Gram. Mula-mula panaskan ose di atas api, ambil NaCl
dengan menggunakan ose dan teteskan di atas kaca objek yang telah diberi batas bentuk oval dibagian bawahnya dengan spidol. Panaskan ose di atas api kembali,
dinginkan dan ambil koloni bakteri dalam cawan media lalu oleskan pada kaca
objek dan ratakan dengan NaCl yang telah diteteskan sebelumnya tidak melewati batas. Keringkan dengan dilewatkan di atas api 2-3 kali atau diamkan hingga
mengering dengan sendirinya. Teteskan Gentian Violet atau Kristal Karbol Ungu KKU, diamkan selama 5 menit, bilas dengan air mengalir. Teteskan lugol,
diamkan selama 3 menit, bilas dengan air mengalir. Teteskan alkohol 96, hingga tidak ada lagi larutan ungu yang luntur. Teteskan safranin, diamkan selama 45
detik hingga 1 menit, bilas dengan air mengalir. Keringkan dengan menggunakan tisu kering dengan tidak mengusap bagian atas gelas objek. Teteskan minyak
immersi, lihat di bawah mikroskop dengan menggunakan pembesaran 100x. 3.6.2.6. Pembuatan dan Identifikasi Koloni dengan Uji Biokimia
1. Fermentasi karbohidrat
Serbuk gula-gula glukosa, laktosa, maltosa, mannitol, dan sukrosa ditimbang sebanyak 1 gr dan air pepton 1 gr, lalu masukkan ke tabung erlenmeyer
250 mL yang telah berisi 100 mL akuades, kemudian dipanaskan pada hotplate selama ± 15 menit, 150
C. Selama memanaskan masukkan sebuk bom chresol purple secukupnya hingga warna menjadi ungu homogen. Setelah dipanaskan
tuang ke dalam tabung reaksi sebanyak 4 ml dan masukkan tabung durham ke dalam tabung reaksi, lalu masukkan seluruh tabung reaksi ke dalam plastik
kemudian sterilisasi di autoklaf selama ± 1-2 jam, setelah itu masukkan ke dalam kulkas bersuhu 3
C. Panaskan ose lalu tunggu hingga dingin, ambil koloni bakteri dari media
spesifik SSA dan EMB lalu masukkan ke dalam tiap tabung reaksi yang berisi uji gula-gula dan kocok hingga koloni menyebar. Lakukan tahap ini pada koloni yang
berbeda. Lalu inkubasi tabung selama 24 jam pada suhu 35 C. Setelah 24 masa
inkubasi akan terjadi reaksi dan perubahan pada warna uji gula-gula, hasil + ditunjukkan dengan warna uji gula-gula berubah menjadi kuning yang
menandakan keadaan asam dengan atau tanpa pembentukan gas pada tabung durham.
2. SIM
Serbuk media SIM ditimbang sebanyak 4 gr, lalu masukkan ke dalam tabung erlenmeyer 250 mL yang telah berisi 100 mL akuades, kemudian
panaskan pada hotplate selama ± 15 menit, 150˚C. Setelah dipanaskan masukkan
ke dalam tabung reaksi sebanyak 4 mL, lalu masukkan seluruh tabung reaksi ke dalam plastik kemudian sterilisasi di autoklaf selama ± 1-2 jam, kemudian
masukkan ke dalam kulkas bersuhu 3 C.
Panaskan ose jarum dan diamkan hingga idak panas, lalu tusuk lurus tepat di tengah pada media uji SIM, lalu inkubasi selama 24 jam pada suhu 30
-35 C.
Amati terjadinya perubahan dengan memberikan 1 mL larutan reagen erlich atau kovac pada tabung, perubahan yang terjadi berupa warna cincin merah pada uji
SIM. 3.
MR-VP
Serbuk media MR-VP ditimbang sebanyak 5 gr, lalu masukkan ke dalam tabung erlenmeyer 250 mL yang telah berisi 100 mL akuades, kemudian
panaskan pada hotplate selama ± 15 menit, 150˚C. Setelah dipanaskan masukkan
ke dalam tabung reaksi sebanyak 4 mL, lalu masukkan seluruh tabung reaksi ke dalam plastik kemudian sterilisasi di autoklaf selama ± 1-2 jam, kemudian
masukkan ke dalam kulkas bersuhu 3 C.
Panaskan ose bulat di atas bunsen, lalu ambil koloni dan masukkan ke dalam tabung reaksi berisi MR dan kocok agar koloni menyebar, kemudian
inkubasi selama 24 jam pada suhu 30 -35
C. Amati terjadinya perubahan dengan memberikan 1 ml reagen methyl red pada tabung. Hasil + berupa warna cincin
merah pada keadaan asam dan berubah menjadi kuning pada keadaan basa. Panaskan ose bulat diatas bunsen, lalu ambil koloni dan masukkan ke
dalam tabung reaksi berisi VP dan kocok agar koloni menyebar, kemudian inkubasi selama 24 jam pada suhu 30
-35 C. Amati terjadinya perubahan dengan
memberikan 1 ml reagen KOH pada tabung. Perubahan yang bisa terlihat adalah perubahan menjadi warna merah pada medium.
4. Uji Sitrat
Serbuk media sitrat ditimbang sebanyak 3 gr, lalu masukkan ke dalam tabung erlenmeyer 250 mL yang telah berisi 100 mL akuades, kemudian
panaskan pada hotplate selama ± 15 menit, 150˚C. Setelah dipanaskan masukkan
ke dalam tabung reaksi sebanyak 4 mL, lalu masukkan seluruh tabung reaksi ke dalam plastik kemudian sterilisasi di autoklaf selama ± 1-2 jam, kemudian
masukkan ke dalam kulkas bersuhu 3 C.
Ambil koloni bakteri dengan ose jarum yang sebelumnya telah dipanaskan, diamkan sebentar lalu oleskan ose tersebut pada bagian lempeng
media sitrat, kemudian inkubasi selama 24 jam pada suhu 37 C. Amati perubahan
warna, perubahan yang tampak adalah perubahan warna media menjadi biru yang menandakan adanya peningkatan pH.
5. TSIA
Serbuk media TSIA ditimbang sebanyak 3 gr, lalu masukkan ke dalam tabung erlenmeyer 250 mL yang telah berisi 100 mL akuades, kemudian
panaskan pada hotplate selama ± 15 menit, 150˚C. Setelah dipanaskan masukkan
ke dalam tabung reaksi sebanyak 4 mL, lalu masukkan seluruh tabung reaksi ke dalam plastik kemudian sterilisasi di autoklaf selama ± 1-2 jam, kemudian
masukkan ke dalam kulkas bersuhu 3 C.
Panaskan ose jarum dan diamkan sebentar hingga tidak terlalu panas, lalu ambil koloni pada media spesifik, kemudian letakkan koloni dengan cara tusuk
lurus stab dan diratakan pada bagian lempengnya. Setelah itu inkubasi selama 24 jam pada suhu 30
-35 C dan amati terjadinya perubahan. Perubahan menjadi
warna hitam menandakan terbentuknya gas H
2
S, merah menandakan basa, dan warna kuning menandakan asam.
3.7 Alur Penelitian