Metode perhitungan bakteri Uji Biokimia

menyebabkan diare dengan BAB cair sebagai tanda awal terjadinya shigellosis dan sindrom hemolitik-uremic, tetapi ini jarang terjadi. 22,29,31

2.1.5 Metode perhitungan bakteri

Terdapat metode perhitungan bakteri secara langsung maupun tidak langsung. Metode dengan cara langsung yaitu petrof hausser cell counter, mikroba dihitung dengan alat haemocytometer secara keseluruhan baik yang masih hidup ataupun mati, cara tidak langsung dapat dilakukan dengan berbagai cara seperti hitung cawan plate count, pengukuran berat kering sel, filtrasi atau penyaringan, pengukuran konsumsi nutrien, dan pengukuran aktivitas metabolisme. 34,35 Perhitungan koloni bakteri pada cawan dapat dilakukan dengan perhitungan Standar Plate Count SPC, salah satu metode yang digunakan adalah Uji Total Plate Count TPC. Uji TPC merupakan uji yang bertujuan untuk mendeteksi kuantitasjumlah dari sel-sel bakteri yang ada pada bahan yang diujikan, setiap koloni yang terbentuk baik besar maupun kecil dan menjalar yang bergabung akan dianggap menjadi satu koloni. Uji TPC dimulai dari pengenceran bahan yang dijadikan sampel, lalu dihomogenisasi dengan media cair NB dengan pengenceran 10 sampai pengenceran 10 -7 , kemudian hasil pengenceran diinokulasi dalam media padat NA dengan menggunakan metode spread plate lalu diinkubasi dalam suhu 37 C selama 24 jam. Setelah diinkubasi koloni bakteri yang tumbuh akan dihitung dengan menggunakan colony counter atau hitung manual dengan kriteria inklusi jumlah bakteri dalam 1 cawan adalah 30-300 koloni. Setelah menghitung jumlah koloni dalam 1 cawan dan termasuk dalam kriteria inklusi maka akan dimasukkan ke rumus sebagai berikut. 34,35 Contoh sampel 1: Pada pengenceran 10 -2 Jumlah koloni=163 Koloni per ml= 163 x 1 10 -2 Koloni per ml= 163 x 10 2 Koloni per ml= 16.300 Setelah menentukan koloni per ml pada setiap pengenceran, selanjutnya dapat menghitung jumlah kuman pada satu sampel dengan rumus sebagai berikut. 34,35

2.1.6 Uji Biokimia

2.1.6.1 Fermentasi Karbohidrat Fermentasi merupakan proses oksidasi secara anaerob yang membutuhkan karbohidrat sebagai substratnya. Fermentasi karbohidrat harus mengandung senyawa yang bisa dioksidasi dan difermentasi oleh bakteri, hasil dari proses fermentasi berbeda-beda tergantung sifat dari tiap bakteri. Ka v vcdrbohidrat yang sering digunakan dalam uji ini adalah glukosa, laktosa, maltosa, mannitol, dan sukrosa. Koloni per ml = jumlah koloni x 1 Konsentrasi pengenceran Bakteri CFUgram = Akumulasi total koloni dalam satu sampel Jumlah pengenceran yang dihitung Kaldu karbohidrat digunakan untuk mengetahui apakah bakteri menghasilkan asam dan gas, untuk mengetahui proses fermentasi menghasilkan asam bisa dideteksi dengan cara melihat apakah terjadi penurunan pH dengan menggunakan indikator. Indikator yang digunakan biasanya brom timol biru atau brom kresol ungu. Jika terjadi penurunan pH maka akan terjadi perubahan warna media menjadi warna kuning, tetapi jika pH diatas 7 maka akan berwarna biru pada brom timol biru atau ungu pada brom kresol ungu. Selain uji pembentukan asam setelah proses fermentasi, pembentukan gas juga diuji dan untuk itu digunakan tabung durham yang bila terbentuk gas maka gas akan masuk ke dalam tabung durham dan akan terlihat seperti gelembung udara yang terperangkap dalam tabung durham. Setelah masa diinkubasi maka dapat diamati perubahan warna dan pembentukan gas dalam tabung yang bisa digunakan sebagai acuan dalam identifikasi bakteri. 28,30 Gambar 2.5 Hasil Uji MR: a. Tidak ada inokulasi, b.Positif, c. Negatif Sumber: Cappuccino James G, Sherman N, 2014 2.1.6.2 Uji MR-VP Tujuan uji MR yaitu untuk mengetahui apakah bakteri mampu untuk menggunakan glukosa monosakarida heksosa sebagai substrat utama untuk menghasilkan energi pada mikroorganisme enterik, hasil akhir dari produksi energi akan bervariasi setiap mikroorganisme. Tes MR akan mendeteksi tingginya konsentrasi asam sebagai produk akhir. Indikator MR akan berubah menjadi merah pada kisaran pH 4, pada pH 6 tetap akan menunjukkan adanya asam tetapi dengan sedikit konsentrasi ion hidrogen dan indikator akan berubah menjadi warna kuning yang berarti negatif. 36 Tujuan uji VP yaitu untuk mengetahui kemampuan bakteri untuk menghasilkan produk akhir yang bersifat tidak asam atau ber-pH netral seperti asetil metil karbinol. Reagen yang digunakan pada test ini menggunakan reagen Barrit yang berisi campuran alkohol α-naftol dan 40 larutan potasium hidroksida KOH. Reaksi ini bisa terjadi dengan adanya katalis α-naftol dan kelompok guanida yang ada pada pepton di media MR-VP, hasilnya berupa kompleks warna pink mawar. Hasil positif pada VP ditunjukkan dengan adanya warna pink mawar yang bertahan sampai 15 menit saat ditambahkan reagen Barrit, hasil negatif ditunjukan dengan tidak terjadi perubahan warna menjadi pink mawar. 36 Gambar 2.6. Hasil Uji VP: a. Tidak ada inokulasi, b. Negatif, c. Positif Sumber: Cappuccino James G, Sherman N, 2014 2.1.6.3 Uji SIM Media agar SIM mengandung substrat triptofan yang akan dikonversi menjadi indol, asam piruvat dan amonia dengan bantuan enzim triptopanase. Adanya produksi indol dideteksi dengan penambahan reagen Kovac yang menghasilkan lapisan warna merah cherri. Indol positif ditunjukkan dengan perubahan warna merah cherri saat dilakukan penambahan reagen kovac. Dan hasil negatif ditunjukkan dengan tidak berubahnya warna SIM agar menjadi merah cherri saat penambahan reagen Kovac yang menunjukkan tidak terjadinya hidrolisis triptofan. 36 Gambar 2.7. Hasil Uji Produksi Indol: a. Tidak ada inokulasi, b. Negatif, c. Positif Sumber: Cappuccino James G, Sherman N, 2014 2.1.6.4 Uji Sitrat Tujuan uji sitrat adalah untuk mengetahui apakah bakteri dapat menggunakan sitrat sebagai sumber karbon untuk sumber energinya karena tidak bisa memfermentasi glukosa dan atau laktosa. Kemampuan ini tergantung adanya permease sitrat yang berguna sebagai transport sitrat masuk ke dalam sel, sitrat aktif saat terdapat enzim sitrase yang akan memproduksi asam oksaloasetik dan asetat. Produk tersebut kemudian secara enzimatik akan dirubah menjadi asam piruvat dan karbon dioksida, selama proses ini media agar menjadi bersifat basa yang berasal dari proses penggabungan karbon dioksida dengan sodium dan air yang membentuk sodium bikarbonat yang bersifat basa. Keadaan basa ini akan mengubah indikator bromtimol blue yang ada pada media agar menyebabkan perubahan warna dari hijau menjadi biru Prussian gelap. Hasil positif sitrat setelah diinkubasi adalah dengan tumbuhnya koloni pada bagian lereng disertai perubahan warna menjadi biru, hasil positif akan terlihat dengan tidak adanya pertumbuhan koloni pada bagian lereng dengan warna hijau. 36 Gambar 2.8. Hasil uji Sitrat: a. Hasil negatif tidak ada pertumbuhan di lereng, b. Hasil positif ada pertumbuhan pada lereng Sumber: Cappuccino James G, Sherman N, 2014 2.1.7.5 Uji TSIA Tujuan uji TSIA adalah untuk membedakan genus yang berbeda-beda dari Enterobacteriaceae, yang semua termasuk dari bakteri batang Gram-negatif yang bisa memfermentasi glukosa dengan memproduksi asam dan membedakan Enterobacteriaceae dari bakteri batang Gram-negatif usus lainnya. Perbedaan terletak pada pola fermentasi karbohidrat dan produksi hidrogen sulfida. Untuk melihat pola penggunaan karbohidrat, pada bagian lereng TSIA mengandung laktosa dan sukrosa dengan konsentasi 1 dan glukosa dengan konsentasi 0.1 . Indikastor asam basa juga ditambahkan berupa phenol red untuk mengetahui fermentasi karbohidrat yang diindikasikan dengan perubahan warna media dari merah-orange ke warna kuning yang menandakan adanya produksi asam. Pada lereng TSIA dibutuhkan inokulasi dengan prosedur “stab-and-streak” yang dilakukan dengan cara memasukkan ose jarum yang streril secara lurus dari lereng ke dasar media TSIA. Berikut hasil inkubasi aktivitas fermentasi bakteri. 36 1. Lereng alkali merah dan dasar asam kuning dengan atau tanpa produksi gas pecahnya dasar agar. Hal ini menandakan hanya terjadi fermentasi glukosa dengan pembentukan asam pada permukaan lereng yang dioksidadi secara cepat. Produksi alkali muncul karena penggunaan pepton dalam media. Pada dasar TSIA reaksi asam dipertahankan karena hasil dari penurunan tensi oksigen dan pertumbuhan yang lambat dari bakteri. 36 2. Lereng asam kuning dan dasar asam kuning dengan atau tanpa produksi gas. Hal ini menandakan telah terjadi fermentasi laktosa dan atau sukrosa. Karena 2 substansi ini ada dengan konsentrasi yang tinggi maka akan digunakan juga sebagai substrat untuk melanjutkan aktivitas fermentasi dengan mempertahankan reaksi asam baik pada lereng maupun dasar. 36 3. Lereng alkali merah dan dasar alkali orange-merah. Hal ini menandakan bahwa tidak terjadi fermentasi, pepton mengalami katabolisme secara aerobik dan atau aerobik yang mengakibatkan pH alkali karena asil dari produksi ammonia. Jika hanya terjadi degradasi aerobik pada pepton maka reaksi alkali hanya terjadi pada bagian lereng. Jika terjadi penggunaan pepton secara aerobik dan anaerobik maka reaksi alkali ada pada bagian lereng dan dasar. 36 Gambar 2.9. Hasil Uji TSIA a. Tidak terjadi inokulasi, b. Lereng basa dan dasar asam dengan H 2 S, c. Lereng basa dan dasar asam, d. Lereng asam dan sadar asam dengan gas, dan e. Lereng asam dan dasar asam Sumber: Cappuccino J G, Sherman N, 2014 Untuk mendapatkan hasil yang akurat pada uji TSIA diharapkan inkubasi selama 18-24 jam, pada media agar TSIA juga mengandung sodium tiosulfat yang merupakan substrat untuk produksi hidrogen sulfida, dan ferrosulfat untuk mendeteksi hasil akhir tanpa warna. Pada mikroorganisme yang bisa memprosukdi H 2 S akan menunjukkan warna hitam pada bagian dasar karena hasil dari endapan ferro sulfida yang tidak larut. Berikut hasil reaksi TSIA pada beberapa mikrooganisme. 36 1. Lereng asam dengan dasar asam tidak menghasilkan H 2 S, contoh bakteri nya yaitu Escherichia, Klebsiella, Enterobacter 2. Lereng asam dengan dasar asam menghasilkan H 2 S, contoh bakteri nya yaitu Citrobacter, Arizona, beberapa Proteus sp. 3. Lereng alkali dengan dasar asam idak menghasilkan H 2 S, contoh bakteri nya yaitu Shigella,dan beberapa Proteus sp. 4. Lereng alkali dengan dasar asam memproduksi H 2 S, contoh bakteri nya yaitu mayoritas Salmonella, Arizona, Citrobacter. 5. Lereng alkali dengan dasar alkali tidak menghasilkan H 2 S, contoh bakteri nya yaitu Alcaligenes, Pseudomonas, Acinetobacter.

2.2. Kerangka Teori