18
BAB III METODE PENELITIAN
Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan metode eksperimental parametrik.Uji aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi agar
menggunakan pencadang kertas.Parameter yang diukur adalah besarnya zona hambat di sekitar pencadang kertas. Tahapan penelitian meliputi pengumpulan
dan pengolahan sampel, skrining fitokimia, pemeriksaan karakterisasi simplisia, pembuatan ekstrak etanol buah babal dengan cara maserasi kemudian difraksinasi
berturut-turut dengan pelarut n-heksana dan etilasetat. Pengujian aktivitas antibakteri terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli.
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Fitokimia dan Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara pada bulan September
2015 – Januari 2016.
3.2 Alat-alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas, alat tanur, aluminium foil, autoklaf Fisons, blender Philips, cakram kertas, cawan
petri, inkubator Fiber Scientific, jangka sorong, jarum ose, kaca objek, Laminar Air Flow Cabinet Astec HLF I200 L, lampu bunsen, lemari pendingin Toshiba,
lemari pengering, oven Memmert, pinset, pipet mikro Eppendorf, rotary evaporatorHaake D, toples kaca, spektrofotometervisible Dynamica Halo Vis-
10 dan neraca analitik Mettler Toledo.
Universitas Sumatera Utara
19
3.3 Bahan-bahan
Bahan-bahan yang digunakan adalah buah babal,akuades, nutrient agarNA, nutrient brothNB, bahan-bahan yang berkualitas proanalisa Merck:
α-naftol,amil alkohol, asam asetat anhidrat, asam klorida pekat, asam nitrat pekat, asam sulfat pekat, besi III klorida, benzena,bismuth III nitrat, dimetilsulfoksida
DMSO, etanol 96, etilasetatnatrium hidroksida,iodium,isopropanol, kalium iodida,kloroform, metanol,n-heksana, raksa II klorida, serbuk magnesium,
timbal II asetat, dan toluene. Bakteri yang digunakan adalah bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923dan Escherichia coli ATCC 25922.
3.4Pembuatan Larutan Pereaksi dan Media 3.4.1 Pembuatan larutan pereaksi
3.4.1.1 Pereaksi asam klorida 2 N
Sebanyak 17 ml larutan asam klorida pekat ditambahkan air suling hingga diperoleh larutan 100 ml Ditjen POM RI, 1995.
3.4.1.2 Pereaksi besi III klorida 1
Sebanyak 1 g besi III klorida dilarutkan dalam air suling sampai 100 ml Depkes, RI., 1995.
3.4.1.3 Pereaksi Bouchardat
Sebanyak 4 g Kalium Iodida ditimbang kemudian dilarutkan dalam air suling secukupnya sampai KI larut dengan sempurna, lalu ditambahkan 2 g
iodium sedikit demi sedikit. Setelah semuanya larut, dicukupkan dengan air suling hingga volume 100 ml Depkes, RI., 1989.
3.4.1.4 Pereaksi Dragendorff
Sebanyak 8,0 g bismuth II nitrat dilarutkan dalam 20 ml asam nitrat dan
Universitas Sumatera Utara
20
Dilarutkan27,2 g kalium iodida dalam 50 ml air suling, lalu dicampurkan kedualarutan dan dicukupkan dengan air suling hingga 100 ml Depkes, RI.,
1989.
3.4.1.5 Pereaksi kloralhidrat
Pereaksi kloralhidrat dibuat dengan cara melarutkan kloralhidrat sebanyak 50 g dalam 20 ml air Depkes, RI., 1995.
3.4.1.6 Pereaksi Liebermann-Burchard
Campurkan 5 ml asam sulfat pekat dengan 50 mletanol.Tambahkan hati- hati 5 ml asam asetat anhidrida ke dalam campuran tersebut dan dinginkan
Depkes, RI., 1995.
3.4.1.7 Pereaksi Mayer
Sebanyak 1,358 g raksa II klorida dilarutkan dalam air suling hingga 60 ml, pada wadah lain ditimbang sebanyak 5 g kalium iodida lalu dilarutkan dalam
10 ml air suling, kedua larutan dicampurkan dan ditambahkan air suling hingga diperoleh larutan 100 ml Ditjen POM RI, 1995.
3.4.1.8 Pereaksi Molish
Sebanyak 3 g alfa naftol dilarutkan dalam 15 ml etanol 95 ditambahkan dengan asam nitrat 0,5 N secukupnya hingga diperoleh larutan 100 ml Depkes,
RI., 1989.
3.4.1.9 Pereaksi natrium hidroksida 2 N
Sebanyak 8,002 g pelet natrium hidroksida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml Ditjen POM RI, 1995.
3.4.1.10 Pereaksi timbal II asetat 0,4 M
Timbal II asetat sebanyak 9,5 g dilarutkan dalam air yang baru dididihkan hingga 100 ml DitjenPOM RI, 1995.
Universitas Sumatera Utara
21
3.4.2 Pembuatan media 3.4.2.1 Media nutrient agar
Komposisi :Lab-Lemco Powder 1,0 g
Yeast Extract 2,0 g
Peptone 5,0 g
Sodium Chloride 5,0 g
Agar 15,0
Cara pembuatan: Sebanyak 28 g nutrient agar ditimbang, disuspensikan ke dalam air
suling sebanyak 1000 ml, lalu dipanaskan sampai bahan larut sempurna lalu disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit Oxoid, 1982.
3.4.2.2 Media nutrient broth
Komposisi : Lab-Lemco powder 1,0
Yeast Extract 2,0
Peptone 5,0
Sodium Chloride 5,0
Cara pembuatan: Sebanyak 13 g serbuk nutrient broth dilarutkan dalam air suling steril
sedikit demi sedikit kemudian volumenya dicukupkan hingga 1 L dengan bantuan pemanasan sampai semua bahan larut sempurna, kemudian disterilkan di autoklaf
pada suhu 121
o
C selama 15 menit Oxoid, 1982.
3.4.2.3 Pembuatan agar miring
Sebanyak 3 ml media nutrient agar cair, dimasukkan ke dalam tabung reaksi, diletakkan pada sudut kemiringan 30°-45°, dibiarkan memadat,
kemudiandisimpan dilemari pendingin Lay, 1994.
Universitas Sumatera Utara
22
3.5Sterilisasi Alat dan Bahan
Alat dan bahan yang digunakan dalam uji aktivitas antibakteri ini disterilkan lebih dahulu sebelum dipakai.Media pertumbuhan disterilkan di
otoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit dan alat-alat gelas disterilkan di oven pada suhu 170° C selama 1-2 jam. Jarum ose dan pinset disterilkan dengan cara
dibakar dengan nyala Bunsen Lay,1994.
3.6Pengumpulan dan Pengolahan Sampel 3.6.1 Pengambilan sampel
Pengambilan bahan dilakukan secara purposif yaitu tanpa membandingkan dengan tumbuhan yang sama dari daerah lain. Bahan penelitian adalah buah babal
Artocarpi heterophylli fructusyang diperoleh dari Dusun I, Desan Dolok Sagala, Kecamatan Dolok Masihul, Kabupaten Serdang Bedagai, Provinsi Sumatera
Utara.
3.6.2 Identifikasi sampel
Identifikasi sampel dilakukan di Herbarium Medanense Universitas Sumatera Utara.
3.6.3 Pembuatan simplisia
Buah babal Artocarpi heterophyllifructusdicuci bersih dari pengotoran dibawah air mengalir dan ditiriskan. Kemudian dipotong-potong tipis dan
dikeringkan dengan cara diangin-anginkan selama 3 hari dan dilanjutkan di lemari pengering dengan suhu 30
o
- 40
o
C selama 4 hari. Buah babal dianggap kering apabila sudah rapuh dapat dipatahkan.Simplisia buah babal yang telah kering
diserbuk menggunakan blender, dan disimpan dalam wadah plastik yang tertutup rapat.
Universitas Sumatera Utara
23
3.7Skrining Fitokimia
Skrining Fitokimia dari serbuk simplisia, ekstrak etanol, n-heksana dan etilasetat meliputi pemeriksaan golongan senyawa alkaloida, flavonoida, saponin,
tanin, glikosida, glikosida antrakinon dan steroidatriterpenoida. 3.7.1 Pemeriksaan alkaloida
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 2
menit didinginkan dan disaring. Filtrat dipakai untuk percobaan sebagai berikut : a. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Meyer, akan
terbentuk endapan menggumpal berwarna putih atau kuning. b. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Bouchardat,
akan terbentuk endapan berwarna coklat sampai hitam. c. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Dragendorff,
akan terbentuk endapan merah atau jingga. Serbuk mengandung alkaloida jika sekurang-kurangnya terbentuk endapan
pada 2 golongan larutan percobaan yang digunakan Depkes, RI., 1995.
3.7.2 Pemeriksaan flavonoida
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia ditambahkan 20 ml air panas, didihkan selama 10 menit dan disaring dalam keadaan panas, ke dalam 5 ml filtrat
ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoida positif jika terjadi warna
merah, kuning, jingga pada lapisan amil alkohol Farnsworth, 1966.
3.7.3 Pemeriksaan saponin
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 10 ml air panas, didinginkan kemudian dikocok selama 10 detik, jika
Universitas Sumatera Utara
24
terbentuk busa setinggi 1 sampai 10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2 N menunjukkan adanya
saponin Depkes, RI., 1995.
3.7.4 Pemeriksaan tanin
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia disari dengan 10 ml air suling kemudian disaring. Filtratnya diencerkan dengan air sampai tidak berwarna.Selanjutnya
larutan diambil sebanyak 2 ml dan ditambahkan 1 sampai 2 tetes pereaksi besi III klorida 1.Jika terjadi warna hijau, biru, atau kehitaman adanya tanin
Farnsworth, 1966.
3.7.5 Pemeriksaan glikosida
Sebanyak 3 g serbuk simplisia disari dengan 30 ml campuran etanol 95dengan air suling 7:3 dan 10 ml asam sulfat 2 N, lalu direfluks selama 1
jam, kemudian didinginkan dan disaring. Pada 20 ml filtrat ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0.4 M, lalu dikocok dan didiamkan 5 menit,
kemudian disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran isopropanol dan kloroform 2:3, dilakukan berulang sebanyak 3 kali.Kumpulan sari air
diuapkandengan temperatur tidak lebih dari 50
o
C.Sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol.
Larutan sisa dipakai untuk percobaan berikut: a.
Larutan sisa dimasukkan ke dalam tabung reaksi selanjutnya diuapkan di atas penangas air, pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes pereaksi molish,
kemudian ditambahkan hati-hati 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung sehingga terbentuk cincin ungu pada batas kedua cairan yang menunjukkan
adanya glikosida.
Universitas Sumatera Utara
25
b. Larutan percobaan diuapkan di atas penangas air, kemudian dilarutkan sisa
dalam 5 ml asam asetat anhidrat, lalu ditambahkan 10 tetes asam sulfat pekat. Terbentuknya warna biru atau hijau menunjukkan adanya glikosida Depkes,
RI., 1995.
3.7.6 Pemeriksaan antrakuinon
Sebanyak 0,2 g serbuk simplisia ditambahkan 5 ml asam sulfat 2 N, dipanaskan, setelah dingin ditambahkan 10 ml benzene, dikocok dan didiamkan.
Lapisan benzena dipisahkan dan disaring.Lapisan benzena dikocok dengan 2 ml NaOH 2 N dan didiamkan.Lapisan air berwarna merah dan lapisan benzena
tidakberwarna menunjukkan adanya glikosida antrakinon Depkes, RI., 1989.
3.7.7 Pemeriksaan triterpensteroid
Ditimbang 1 g serbuk simplisia, maserasi dengan n-heksana selama 2 jam,lalu disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan penguap.Pada sisanya
ditambahkan asam asetat anhidrida dan 1 tetes asam sulfat pekat.Timbul warna biru atau hijau menunjukkan adanya steroid dan timbul waran merah, pink atau
ungu menunjukkan adanya triterpenoid Fansworth, 1966.
3.8Karakterisasi Simplisia 3.8.1 Pemeriksaan makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia buah babal dengan mengamati bentuk, bau, rasa dan warna.
3.8.2 Pemeriksaan mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia buah babal.Serbuk simplisia ditaburkan diatas kaca objek yang telah ditetesi dengan
Universitas Sumatera Utara
26
larutan kloralhidrat dan ditutup dengan kaca penutup, kemudian diamati dibawah mikroskop.
3.8.3 Penetapan kadar air
a. Penjenuhan toluen
Sebanyak 200 ml toluen dimasukkan kedalam labu alas bulat, lalu ditambahkan 2 ml air suling, kemudian alat dipasang dan dilakukan destilasi
selama 2 jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan dingin selama ± 30 menit, kemudian volume air dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,1 ml.
b. Penetapan kadar air simplisia
Labu berisi toluene dimasukkan 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama, dipanaskan hati-hati selama 15 menit, setelah toluene mendidih,
kecepatan toluene diatur 2 tetes per detik sampai sebagian besar air terdestilasi, lalu kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 tetes per detik dan setelah semua air
terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu
kamar. Setelah air dan toluene memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,1 ml. Selisih kedua volume air dibaca sesuai kadar air yang terdapat
pada bahanyang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen WHO, 1992.
3.8.4 Penetapan kadar sari larut dalam air
Sebanyak 5 g serbuk simplisia dimaserasi selama 24 jam dalm 100 ml air- kloroform 2,5 ml kloroform dalam aquadest sampai 1 L dengan menggunakan
botol bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam dan disaring. Sebanyak 20 ml filtrat diuapkan hingga
kering dalam cawan yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara.Residu
Universitas Sumatera Utara
27
dipanaskan dalam oven pada suhu 105°C sampai diperoleh bobot tetap.Kadar sari yang larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes, RI.,
1995.
3.8.5 Penetapan kadar sari larut dalam etanol
Sebanyak 5 g serbuk simplisia dimaserasi selama 24 jam dalam 100 mletanol 80 dengan menggunakan botol tersumbat sambil sesekali dikocok
selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam dan disaring. Sebanyak 20 mlfiltrat diuapkan hingga kering dalam cawan berdasar rata yang telah
dipanaskan dan ditara.Residu dipanaskan dalam oven pada suhu 105°C sampai diperoleh bobot tetap.Kadar sari larut dalam etanol dihitung terhadap bahan yang
telah dikeringkan Depkes, RI., 1995.
3.8.6 Penetapan kadar abu total
Sebanyak 2,5 g serbuk simplisia yang telah digerus dan ditimbang seksama,dimasukkan ke dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara,
kemudian diratakan. Krus porselin bersama isinya dipijarkan perlahan hingga arang habis, didinginkan, ditimbang sampai diperoleh bobot yang tetap.Kadar
abudihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Depkes, RI., 1995.
3.8.7 Penetapan kadar abu yang tidak larut asam
Abu yang diperoleh pada penetapan kadarabu total didihkan dengan 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut asam dikumpulkan,
disaring dengan kertas saring, lalu cuci dengan air panas. Residu dan kertas saring dipijarkan sampai diperoleh bobot yang tetap, dinginkan, dan ditimbang
beratnya.Kadar abu yang tidak larut asam dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Depkes, RI., 1995.
Universitas Sumatera Utara
28
3.9Pembuatan Ekstrak
Pembuatan ekstrak dilakukan dengan cara maserasi menggunakan pelarut etanol 80. Cara kerja :
Sebanyak 500 g serbuk simplisia dimaserasi dengan 75 bagian pelarut 3750 ml etanol 80, dimasukkan ke dalam bejana bertutup dan dibiarkan pada
suhu kamar selama 5 hari terlindung dari cahaya sambil sering diaduk, kemudian setelah 5 hari hasil maserasi disaring dan diperas. Ampas ditambah dengan cairan
penyari etanol 80 hingga diperoleh 100 bagian 5 L maserat kemudian dibiarkan di tempat sejuk dan terlindung dari cahaya selama 2 hari dan
dienaptuangkan. Seluruh maserat digabungkan diuapkan dengan alat rotary evaporator pada temperatur kurang lebih 40°C dan diperoleh ekstrak etanol kental
kemudian dikeringkan dengan freeze dryer Ditjen POM RI, 1995.
3.10Pembuatan Fraksi n-Heksana dan Fraksi Etilasetat
Pembuatan fraksi-fraksi dilakukan ekstraksi cair-cair ECC menggunakan pelarut n-heksana dan etilasetat. Sebanyak 10 g ekstrak etanol ditambahkan 40 ml
etanol dan 100 ml air suling dihomogenkan, dimasukkan kedalam corong pisah, diekstraksi dengan 50 mln-heksana, dikocok, didiamkan sampai terbentuk 2
lapisan yaitu fraksi n-heksana dan fraksi air. Fraksi n-heksana dikumpulkan dan difraksinasi sampai lapisan n-heksana jernih.Fraksi air lalu diekstraksi dengan 50
ml etilasetat, dikocok, didiamkan sampai terbentuk 2 lapisan yaitu fraksi etilasetat dan fraksi air.Fraksi etilasetat dikumpulkan dan fraksinasi dilakukan sampai
lapisan etilasetat jernih.Fraksi n-heksana dan etilasetat diuapkan dengan rotary evaporator hingga diperoleh ekstrakkental Harborne, 1987.
Universitas Sumatera Utara
29
3.11Pembuatan Larutan Uji dengan Berbagai Konsentrasi
Ekstrak etanol buah babal ditimbang 2 g kemudian dilarutkan dengan pelarut DMSO hingga 4 ml maka konsentrasi ekstrak adalah 500 mgml. Larutan
tersebut diencerkan kembali dengan pelarut DMSO sehingga didapat konsentrasi 400 mgml; 300 mgml; 200 mgml; 100 mgml; 75 mgml; 50 mgml; 25 mgml;
20 mgml; 15 mgml; 12,5 mgml; 10 mgml;5 mgml. Dilakukan prosedur yang sama untuk fraksi n-heksana dan fraksi etilasetat.
3.12Pembiakan Bakteri 3.12.1 Pembuatan stok kultur bakteri
Suatu koloni bakteri diambil dengan menggunakan jarumose kecil. Koloni bakteri tersebut kemudian ditanamkan pada media nutrient agar miring
dengancara menggores dan diinkubasi dalam inkubator pada suhu 36±1°C selama 24jam.
3.12.2 Penyiapan inokulum bakteri
Koloni bakteri diambil dari stok kultur bakteri yang telah tumbuh pada media nutrient agar miring diambil dengan menggunakan jarum ose steril. Koloni
bakteri tersebut kemudian disuspensikan ke dalam tabung yang berisi 10 ml larutan nutrient broth, kemudian diukur kekeruhan larutan menggunakan alat
spektrofotometer visible pada panjang gelombang 580 nm sampai diperoleh transmitan 25 Ditjen POM RI, 1995.
3.13 Uji Aktivitas Antibakteri
Sebanyak 0,1 ml inokulum dimasukkan kedalam cawan petri steril, laludituang media nutrient agar sebanyak 20 ml dengan suhu 45°-50° C. Cawan
Universitas Sumatera Utara
30
petri dihomogenkan di atas permukaan meja agar media dan suspensi bakteri tercampur rata dan dibiarkan memadat. Dilakukan pengujian aktivitas antibakteri
dengan metode difusi cakram kertas yaitu dengan meletakkan cakram kertas yang telah direndam dalam beberapa konsentrasi larutan uji ekstrak etanol di atas media
padat yang telah diinokulasi bakteri dan di biarkan 15 menit, kemudian diinkubasi dalam inkubator pada suhu 36±1° C selama 18-24 jam, setelah itu diukur diameter
daerah hambatan zona jernih pertumbuhan di sekitar cakram dengan menggunakan jangka sorong. Uji aktivitas antibakteri fraksi n-heksana dan fraksi
etilasetat dilakukan dengan cara yang sama pada ekstrak etanol.
Universitas Sumatera Utara
31
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Identifikasi Tumbuhan
Hasil identifikasi tumbuhan yang dilakukan di Herbarium Medanense MEDA Universitas Sumatera Utara adalah Artocarpus heterophyllus
Lamk.,suku Moraceae, bangsa Urticales, kelas Dicotyledoneae, Divisi Spermatophyta. Hasil dapat dilihat pada Lampiran 1, halaman 43.
4.2 Hasil Pemeriksaan Karakterisasi 4.2.1 Pemeriksaan makroskopik
Hasil pemeriksaan makroskopik morfologi luar buah babal yaitu permukaan kulitnya sedikit kasar, diameter ± 3 cm. Pemeriksaan organoleptis
buah babal yaitu berwarna hijau muda, rasanya kelat dan tidak berbau. Hasil pemeriksaan makroskopik morfologi luar simplisia buah babal yaitu permukaan
kulitnya sedikit kasar, diameternya ± 2cm. Pemeriksaan organoleptis simplisia buah babal yaitu berwarna coklat tua, berkeriput, tidak berasa serta tidak berbau.
4.2.2 Pemeriksaan mikroskopik
Hasil pemeriksaan mikroskopik buah babal memperlihatkan adanya rambut penutup, jaringan parenkim berisi kristal kalsium oksalat bentuk druse,
epidermis, tetes minyak atsiri dan pembuluh kayu penebalan tangga. Hasil pemeriksaan dapat dilihat pada Lampiran 5, halaman 47.
4.2.3 Hasil pemeriksaan karakterisasi serbuk simplisia
Hasil pemeriksaan karakterisasi serbuk simplisia buah babal dapat dilihat pada Tabel 4.1 Data selengkapnya pada Lampiran 9, halaman 51-54.
Universitas Sumatera Utara
Kategori