Fania Maulani Rahmy : Perbedaan Daya Hambat Kitosan Blangkas Lymulus polyphemus Bermolekul Tinggi Dengan Pelarut Gliserin Dan VCO Virgin Coconut Oil Terhadap Fusobacterium nucleatum ATCC 25586 Penelitian
IN-VITRO, 2009. USU Repository © 2009
Gambar 15 . Biakan Fusobacterium nucleatum pada petri dish yang telah tumbuh subur, terlihat dibawah mikroskop, pembesaran 100gpi
Pada hasil pengkulturan dilihat apakah telah didapatkan biakan bakteri Fusobacterium nucleatum subur dan murni tanpa terjadi mutasi atau kematian.
Apabila pertumbuhan bakteri tidak subur dan terjadi kontaminasi bakteri lain, prosedur pembiakan dan pengamatan diulang kembali. Setelah hasil didapat, diambil
beberapa koloni bakteri lalu diencerkan dengan larutan isotonis NaCl 0,9 atau Phosphat Buffer Saline hingga didapatkan kekeruhan yang sama dengan standard 0,5
Mac Farland atau sebanding dengan konsentrasi bakteri 1 x 10
8
CFUml.
4.7.3 Persiapan bahan coba
Pada penelitian ini, pembuatan suspensi bahan coba dilakukan pada konsentrasi yang sama dengan penambahan asam asetat 1 lalu dicampurkan dengan
bahan pelarut vehicle. Konsentrasi yang digunakan ialah 1, 0,5 dan 0,25. Sejumlah bahan coba yaitu 1 gr bubuk kitosan untuk konsentrasi 1, 0,5 gr bubuk
kitosan untuk konsentrasi 0,5 dan 0,25 gr bubuk kitosan untuk konsentrasi 0,25 dicampur dengan 100ml asam asetat 1, lalu dicampur merata divortex. Hasil
Fania Maulani Rahmy : Perbedaan Daya Hambat Kitosan Blangkas Lymulus polyphemus Bermolekul Tinggi Dengan Pelarut Gliserin Dan VCO Virgin Coconut Oil Terhadap Fusobacterium nucleatum ATCC 25586 Penelitian
IN-VITRO, 2009. USU Repository © 2009
pencampuran ini dari setiap konsentrasi tersebut diambil sebanyak 9 ml dan dimasukkan ke dalam tabung sesuai label, lalu ditambahkan dengan bahan pelarut
yakni gliserin dan VCO sebanyak 1 ml sesuai dengan konsentrasinya. Untuk kontrol yakni gliserin 100 dan VCO 100, pada setiap tabung reaksi hanya diberi 1 ml
bahan pelarut saja tanpa penambahan larutan kitosan blangkas. Masing-masing konsentrasi bahan coba dibuat dalam 5 tabung.
4.7.4 Penentuan perbedaan daya hambat kitosan blangkas dengan pelarut
gliserin dan VCO pada konsentrasi yang sama
Dalam penelitian ini bahan coba dibagi atas 3 kelompok yaitu: 1.
Larutan kitosan blangkas 1, 0,5 dan 0,25 dengan 1 ml pelarut gliserin 100
2. Larutan kitosan blangkas 1, 0,5 dan 0,25 dengan 1 ml pelarut VCO
100
Gambar 17. Vorteks Iwaki TM-100, Japan
Gambar 16. Electronic balance Ohyo JP2 6000
,
Fania Maulani Rahmy : Perbedaan Daya Hambat Kitosan Blangkas Lymulus polyphemus Bermolekul Tinggi Dengan Pelarut Gliserin Dan VCO Virgin Coconut Oil Terhadap Fusobacterium nucleatum ATCC 25586 Penelitian
IN-VITRO, 2009. USU Repository © 2009
3. Gliserin 100 dan VCO 100 sebagai kontrol
Bahan coba yang telah dipersiapkan sebelumnya didalam tabung reaksi diberi label sesuai dengan konsentrasinya. Suspensi bakteri yang telah dibuat sesuai dengan
kekeruhan 0,5 Mac Farland diambil sebanyak 1 ml, lalu dimasukkan ke masing- masing tabung sesuai konsentrasi bahan coba, begitu juga pada kontrol gliserin 100
dan VCO 100. Selanjutnya diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator CO
2
dengan suhu 37°C.
Prosedur penentuan perbedaan daya hambat kitosan blangkas dengan pelarut gliserin dan kitosan blangkas dengan pelarut VCO pada konsentrasi yang sama
dilakukan dengan metode Drop Plate Miles Misra yang digunakan pada modifikasi metode dilusi untuk verifikasi hasil dan menentukan apakah kekeruhan yang terjadi
disebabkan oleh pertumbuhan bakteri atau karena suspensi bahan coba. Pada bahan coba ini tidak dilakukan pengenceran karena kondisi pelarut yang tidak
memungkinkan. Prosedur Drop Plate Miles Misra dimulai dengan mengambil sebanyak 50µ l
bahan coba yang telah diinkubasi dengan mikropipet, lalu ditanam ke dalam media padat yakni Mueller Hinton Agar MHA. Setiap satu petri media tanam dibagi atas 5
bagian, dimana setiap tetes bahan coba memiliki konsentrasi yang sama tetapi berasal dari tabung yang berbeda. Dalam prosedur ini dilakukan 5 kali replikasi pada media
yang berbeda sehingga diperoleh 5 petri untuk setiap konsentrasi. Setelah diteteskan, media didiamkan sekitar 15-20 menit agar mengering lalu dimasukkan ke dalam
Fania Maulani Rahmy : Perbedaan Daya Hambat Kitosan Blangkas Lymulus polyphemus Bermolekul Tinggi Dengan Pelarut Gliserin Dan VCO Virgin Coconut Oil Terhadap Fusobacterium nucleatum ATCC 25586 Penelitian
IN-VITRO, 2009. USU Repository © 2009
inkubator CO
2
dengan suhu 37°C selama 24 jam. Selanjutnya koloni kuman yang tumbuh pada media agar dapat dihitung.
Prinsip perhitungan jumlah bakteri adalah setiap satu sel bakteri hidup bila dibiakkan pada media padat akan tumbuh menjadi satu koloni kuman. Bila bentuk
koloni melebar dianggap berasal dari satu koloni, bila bentuk 2 koloni bersinggungan dianggap sebagai 2 koloni, satuan yang dipakai adalah CFU Colony Forming Unit
ml cairan suspensi. Apabila pada petri dish mengandung banyak koloni, dimana terlihat pertumbuhan bakteri yang sulit untuk dihitung, maka pada konsentrasi
tersebut dianggap tidak bisa untuk dihitung TBUD. Setelah dihitung jumlah koloni kuman pada masing-masing tetesan, lalu
dibuat jumlah rata-rata dan dikalikan dengan faktor pengenceran dan faktor pengali untuk tiap petri. Oleh karena bahan coba pada penelitian tidak dilakukan pengenceran
maka faktor pengenceran dikali 1, selain itu karena penanaman bahan coba pada media padat sebanyak 50µ l, maka koloni bakteri dikali faktor pengali 20 untuk
mendapatkan satuan CFUml satuan standar.
Misalnya : Hasil perhitungan koloni rata-rata tiap petri :
a. Petri 1 = 2
b. Petri 2 = 2
Fania Maulani Rahmy : Perbedaan Daya Hambat Kitosan Blangkas Lymulus polyphemus Bermolekul Tinggi Dengan Pelarut Gliserin Dan VCO Virgin Coconut Oil Terhadap Fusobacterium nucleatum ATCC 25586 Penelitian
IN-VITRO, 2009. USU Repository © 2009
c. Petri 3 = 3
d. Petri 4 = 4
e. Petri 5 = 5
Dirata-ratakan x = n5 Faktor pengenceran = 1 karena bahan coba tidak diencerkan maka nilainya sama
dengan 1 Faktor pengali = 20 karena bahan coba yg diteteskan sebanyak 50µ l
Maka, jumlah bakteri yang tumbuh = jumlah rata-rata koloni x faktor pengencer x faktor pengali
= n5 x 1 x 20 = X CFUml
BAB 5 HASIL PENELITIAN
