BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN
3.1. Tempat dan Waktu
Penelitian akan dilaksanakan di Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara dan Laboratorium Patologi Anatomi FK USU, Medan.
Penelitian dilakukan selama ±2 dua bulan, 30 Mei - 22 Juli 2009.
3.2. Rancangan Penelitian
Penelitian ini dilakukan dengan rancangan eksperimental dengan desain Rancangan Acak Lengkap RAL. Mencit jantan Mus musculus, L strain DD
Webster dewasa, sebanyak 25 ekor, dengan menggunakan rumus Frederer Frederer, 1963 yaitu: t-1 n-1 15
Di mana : t = jumlah perlakuan n = jumlah ulangan
yang dibagi dalam 5 kelompok perlakuan, yaitu 2 kelompok kontrol kelompok kontrol pertama diberi aquadest selama 30 hari dan kelompok kontrol kedua
diberi MSG selama 15 hari pertama dan 15 hari berikutnya pemberian MSG dihentikan dan diganti dengan pemberian aquadest dan 3 kelompok perlakuan
kelompok perlakuan pertama diberi MSG selama 30 hari, kelompok perlakuan kedua diberi MSG selama 15 hari pertama dan 15 hari berikutnya pemberian
MSG dihentikan dan diganti dengan vitamin C dan kelompok perlakuan ketiga
Julahir Hodnatua Siregar : Pengaruh Pemberian Vitamin C Terhadap Jumlah Sel Leydig Dan Jumlah Sperma Mencit Jantan Dewasa Mus musculus, L. Yang Dipapari Monosodium Glutamate MSG, 2009.
diberi MSG selama 15 hari pertama dan 15 hari berikutnya ditambah dengan pemberian vitamin C, masing-masing terdiri atas 5 mencit jantan. Mencit
ditempatkan ke dalam kelompok secara random.
3.3. Bahan dan Alat Penelitian
3.3.1. Bahan Penelitian
Bahan biologis. Bahan biologis yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah mencit jantan Mus musculus, L strain DD Webster dewasa. Mencit jantan
dewasa merupakan hasil perbanyakan hewan yang diperoleh dari Universitas Gajah Mada Yogyakarta, sebanyak 25 ekor mencit jantan dipilih dari hasil perbanyakan
untuk keperluan penelitian. Sebelum dilakukan perlakuan, 25 ekor mencit jantan dewasa tersebut terlebih dahulu dilakukan uji fertilitas yaitu dengan cara
mengawinkan masing-masing mencit jantan dewasa dengan satu mencit betina dewasa dan jika terjadi pembuahan yang ditandai dengan buntingnya mencit betina
dewasa tersebut maka mencit jantan dewasa yang membuahinya dianggap fertil.
Bahan Kimia
a. Larutan fiksatif Bouin.
b. Alkohol 70,80,90,96 dan alkohol absolut.
c. Parafin.
d. Hematoxylin_Eosin H-E.
Julahir Hodnatua Siregar : Pengaruh Pemberian Vitamin C Terhadap Jumlah Sel Leydig Dan Jumlah Sperma Mencit Jantan Dewasa Mus musculus, L. Yang Dipapari Monosodium Glutamate MSG, 2009.
3.3.2. Alat-alat
Alat utama yang digunakan dalam penelitian antara lain: jarum oval Gavage, spuit 1 ml, bak bedah dan dissecting set, gelas arloji, cawan petri, batang pengaduk,
kamar hitung Neubauer, mikroskop cahaya, objek glass, mikrotom, oven.
3.4. Variabel Penelitian
3.4.1. Variabel Independen
1. Monosodium Glutamate.
2. Vitamin C.
3.4.2. Variabel Dependen
1. Jumlah sel leydig.
2. Jumlah sperma.
3.5. Pelaksanaan Penelitian dan Pengamatan
3.5.1. Pemeliharaan Hewan Percobaan
Mencit ditempatkan di dalam kandang yang terbuat dari bahan plastik ukuran 30x20x10 cm yang ditutup dengan kawat kasa. Dasar kandang dilapisi dengan
sekam padi setebal 0,5-1 cm dan diganti setiap tiga hari. Cahaya ruangan dikontrol persis 12 jam terang pukul 06.00 sampai dengan pukul 18.00 dan 12 jam gelap
pukul 18.00 sampai dengan pukul 06.00, sedangkan suhu dan kelembaban ruangan dibiarkan berada pada kisaran alamiah. Pakan pelet komersial dan minum air
PAM disuplai setiap hari.
Julahir Hodnatua Siregar : Pengaruh Pemberian Vitamin C Terhadap Jumlah Sel Leydig Dan Jumlah Sperma Mencit Jantan Dewasa Mus musculus, L. Yang Dipapari Monosodium Glutamate MSG, 2009.
3.5.2. Pemberian Perlakuan
Pemberian dosis MSG terlebih dahulu dilarutkan dalam aquades sebanyak 0,5ml. Aquades yang diberikan pada kelompok kontrol sebanyak 0,5 ml.
1. Kelompok 1 P1 = Kelompok kontrol pertama terdiri 5 ekor mencit dewasa
jantan yang diberi aquadest selama 30 hari. 2.
Kelompok 2 P2 = Kelompok kontrol kedua terdiri dari 5 ekor mencit dewasa jantan yang diberi MSG 4 mgg berat badan secara intraperitoneal setiap hari
selama 15 hari pertama dan 15 hari berikutnya pemberian MSG dihentikan dan diganti dengan pemberian aquadest.
3. Kelompok 3 P3 = Kelompok perlakuan pertama terdiri dari 5 ekor mencit
dewasa yang diberi MSG 4 mgg berat badan secara intraperitoneal setiap hari selama 30 hari.
4. Kelompok 4 P4 = Kelompok perlakuan kedua terdiri dari 5 ekor mencit
dewasa yang diberi MSG 4 mgg berat badan secara intraperitoneal setiap hari selama 15 hari pertama dan 15 hari berikutnya pemberian MSG dihentikan
dan diganti dengan pemberian vitamin C 0,2 mgg berat badan secara oral setiap hari.
5. Kelompok 5 P5 = Kelompok perlakuan ketiga terdiri dari 5 ekor mencit
yang diberi MSG 4 mgg berat badan selama 15 hari pertama dan 15 hari berikutnya MSG tetap diberikan dan ditambah dengan pemberian vitamin C
0,2 mgg berat badan secara oral setiap hari.
Julahir Hodnatua Siregar : Pengaruh Pemberian Vitamin C Terhadap Jumlah Sel Leydig Dan Jumlah Sperma Mencit Jantan Dewasa Mus musculus, L. Yang Dipapari Monosodium Glutamate MSG, 2009.
Mencit ditempatkan ke dalam kelompok secara random.
Tabel 3.1. Desain Perlakuan
3.5.3. Prosedur Pemeriksaan dan Pengamatan
Setelah perlakuan selama 30 hari, masing-masing hewan percobaan dikorbankan dengan cara dislokasi leher, selanjutnya dibedah.
1. Jumlah sel leydig
Cara Kerja
Pembuatan sediaan histologis testis Pembuatan sediaan histologis menurut Suntoro, S.H, 1983 dengan metode
parafin adalah: fiksasi, pencucian, dehidrasi, penjernihan, infiltrasi parafin, penanaman, pengirisan, penempelan, deparafinasi, pewarnaan, penutupan serta
pemberian label.
Julahir Hodnatua Siregar : Pengaruh Pemberian Vitamin C Terhadap Jumlah Sel Leydig Dan Jumlah Sperma Mencit Jantan Dewasa Mus musculus, L. Yang Dipapari Monosodium Glutamate MSG, 2009.
Fiksasi
Organ testis yang telah dipotong-potong kemudian dimasukkan kedalam larutan fiksatif Bouin selama 2-10 jam.
Pencucian
Setelah proses fiksasi dilakukan pencucian dengan alkohol 70.
Dehidrasi
Dilakukan secara bertahap, dengan alkohol 70 selama 10 menit, alkohol 80,90,96, masing-masing selama 60 menit, kemudian dengan alkohol absolut
selama 30 menit.
Penjernihan
Dilakukan segera setelah proses dehidrasi dengan menggunakan toluol murni.
Infiltrasi Parafin
Proses infiltarsi parafin dilakukan di dalam oven dengan suhu 56 C. Organ
testis dimasukkan kedalam campuran toluol-parafin denagn perbandingan 1:1 selama 30 menit. Kemudian berturut dimasukkan kedalam:
Parafin Murni I selama 60 menit Parafin Murni II selama 60 menit
Parafin Murni III selama 60 menit
Penanaman
Sediaan dari Parafin murni III dimasukkan kedalam kotak kertas kecil sebagai cetakan yang telah berisi parafin cair, dan dibiarkan sampai parafin mengeras.
Julahir Hodnatua Siregar : Pengaruh Pemberian Vitamin C Terhadap Jumlah Sel Leydig Dan Jumlah Sperma Mencit Jantan Dewasa Mus musculus, L. Yang Dipapari Monosodium Glutamate MSG, 2009.
Pengirisan
Blok parafin testis yang telah mengeras ditempelkan pada holder kayu sampai melekat erat, kemudian dipasangkan pada mikrotom. Pengirisan dilakukan dengan
ketebalan 6m.
Penempelan
Pada gelas benda diolesi dengan larutan albumin mayer dan ditetesi dengan aquadest. Kemudian beberapa pipa parafin diletakkan di permukaan akuades pada
gelas benda dan dibiarkan beberapa saat, kemudian gelas benda dipindahkan ke meja pemanas hingga kering.
Pewarnaan
Pewarnaan dengan hematoxylin_Eosin H-E melalui tahapan a.
Preparat dideparafinasi dalam xylol sampai bebas parafin. b.
Dimasukkan dalam alkohol 96, 90, 80, 70, 50, 30, akuades. c.
Dimasukkan dalam larutan hematoxylin Erlich selam 1 menit. d.
Dicuci dengan air mengalir, dicelupkan kedalam akuades, alkohol 30, 50, 70.
e. Kemudian dimasukkan kedalam larutan Eosin 0,5 selama 1 menit.
f. Kemudian dimasukkan kedalam alkohol 70, 80, 90 dan alkohol absolut.
g. Selanjutnya dimasukkan kedalam xylol.
Penutupan
Preparat ditutup dengan gelas penutup setelah ditetesi dengan canada balsem terlebih dahulu, lalu diberi label.
Julahir Hodnatua Siregar : Pengaruh Pemberian Vitamin C Terhadap Jumlah Sel Leydig Dan Jumlah Sperma Mencit Jantan Dewasa Mus musculus, L. Yang Dipapari Monosodium Glutamate MSG, 2009.
Penghitungan Jumlah Sel Leydig
Jumlah sel Leydig dihitung pada semua lapangan pandang, kecuali pada sediaan yang tubulus seminiferusnya terpotong lebih dari setengah. Tiap mencit
dihitung jumlah sel Leydignya pada tiga 3 preparat yang kemudian diambil rata-rata dari ketiga preparat tersebut.
2. Penghitungan jumlah sperma.
Cara Kerja
Prosedur pengambilan sekresi cauda epididimis Organ testis beserta epididimis diambil dan diletakkan kedalam cawan petri
yang berisi NaCl 0,9. Di bawah mikroskop bedah dengan pembesaran 400 kali. Cauda epididimis dipisahkan dengan cara memotong bagian proximal epididimis dan
bagian distal vas deferns. Selanjutnya cauda epididimis dimasukkan kedalam gelas arloji yang berisi 1 ml NaCl 0,9 kemudian proximal cauda epididimis dipotong
sedikit dengan gunting lalu kauda ditekan dengan perlahan hingga sekresicairan epididimis keluar dan tersuspensi dengan NaCl 0,9.
Pengamatan Jumlah Sperma
Pengamatan jumlah sperma dilakukan menurut Soehadi dan Arsyad 1983. Suspensi spermatozoa yang telah diperoleh terlebih dahulu dihomogenkan.
Selanjutnya diambil sebanyak 10 λ, σαmπελ διmασυκκαν κε δαλαm κοτακ καmαρ hitung Improved Neubauer serta ditutup dengan kaca penutup. Dilihat di bawah
mikroskop cahaya dengan pembesaran 400 kali. Hasil perhitungan dimasukkan kedalam rumus
Julahir Hodnatua Siregar : Pengaruh Pemberian Vitamin C Terhadap Jumlah Sel Leydig Dan Jumlah Sperma Mencit Jantan Dewasa Mus musculus, L. Yang Dipapari Monosodium Glutamate MSG, 2009.
Jumlah Sperma = N2 x 10
5
spermatozoaml suspensi N : jumlah sperma yang dihitung dalam kotak
Gambar 3.1. Kamar Hitung Improved Neubauer Zaneveld et al, 1986
3.6. Analisis Data dan Pengujian Hipotesis
Semua data dipresentasikan dalam bentuk rata-rata ± σιmπανγαν βακυ ρατa- rata ± ΣD. Dilakukan uji normalitas dan homogenitas data SPSS 15.0. Dari hasil
penelitian didapatkan data dengan distribusi normal dan homogen, sehingga dilakukan uji parametrik Anova.
Julahir Hodnatua Siregar : Pengaruh Pemberian Vitamin C Terhadap Jumlah Sel Leydig Dan Jumlah Sperma Mencit Jantan Dewasa Mus musculus, L. Yang Dipapari Monosodium Glutamate MSG, 2009.
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Deskripsi Hasil Penelitian
Penelitian dimulai dari tanggal 30 Mei - 22 Juli 2009, hal ini lebih dari 30 hari dikarenakan adanya beberapa mencit yang mati sewaktu penelitian, dan ini
mengganggu sampel, sehingga perlu diganti. Selama pemeliharaan, berat badan dan aktivitas setiap hewan coba terus
diperhatikan. Untuk membedakan setiap mencit diberi tanda spidol di badan mencit. Pemberian MSG diberikan secara intraperitoneal, di mana dosisnya
ditentukan sesudah berat badannya ditimbang lebih dulu setiap hari. Pemberian Vitamin C secara oral juga dilakukan setelah penimbangan berat badan dilakukan
terlebih dahulu.
4.1.1. Pengambilan Organ
Pengambilan organ testis dan caudal epididimis dilakukan setelah dilakukan perlakuan selama 30 hari, dan hari ke-31 baru organ tersebut diambil dengan
melakukan dislokasi dan laparotomi. Organ caudal epididimis dimasukkan ke piring petri, testis diambil dan dimasukkan ke tabung berisi larutan fiksatif.
Julahir Hodnatua Siregar : Pengaruh Pemberian Vitamin C Terhadap Jumlah Sel Leydig Dan Jumlah Sperma Mencit Jantan Dewasa Mus musculus, L. Yang Dipapari Monosodium Glutamate MSG, 2009.