Jenis dan Rancangan Penelitian Alat Penelitian Tata Cara Analisis Hasil

20

BAB III METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian merupakan penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola searah.

B. Variabel dan Definisi Operasional

Variabel – variabel yang digunakan pada penelitian ini adalah :

1. Variabel utama

a. Variabel bebas Variasi dosis pemberian infusa kulit buah Persea americana Mill. pada tikus jantan galur Wistar yang terinduksi karbon tetraklorida. b. Variabel tergantung Peningkatan kadar albumin tikus jantan galur Wistar yang terinduksi karbon tetraklorida setelah pemberian jangka panjang infusa kulit buah Persea americana Mill.

2. Variabel pengacau

a. Variabel pengacau terkendali Kondisi hewan uji yaitu tikus jantan galur Wistar, berat badan 150 – 250 gram dan berumur 2 – 3 bulan, frekuensi waktu pemberian infusa kulit buah Persea americana Mill. selama 6 hari dan cara pemberian infusa yaitu secara peroral serta bahan kulit buah Persea americana Mill. b. Variabel pengacau tak terkendali Kondisi patologis dari tikus jantan galur Wistar yang digunakan sebagai hewan uji.

3. Definisi operasional

a. Infusa kulit Persea americana Mill. Infusa serbuk kering kulit buah Persea americana Mill. didapatkan dengan cara menginfundasi 8 gram serbuk kering kulit buah Persea americana Mill. dalam 100,0 mL air pada suhu 90 o C selama 15 menit. b. Pemberian jangka panjang Didefinisikan sebagai pemberian infusa kulit buah Persea americana Mill. satu kali sehari selama enam hari berturut-turut dalam waktu pemberian yang sama. c. Peningkatan kadar albumin pada serum tikus Peningkatan kadar albumin pada serum tikus merupakan kemampuan infusa kulit buah Persea americana Mill. pada dosis tertentu untuk menaikkan kadar albumin pada serum tikus jantan galur Wistar terinduksi karbon tetraklorida. d. Dosis efektif infusa kulit Persea americana Mill. Dosis efektif merupakan sejumlah gram per kilogram berat badan gkgBB infusa kulit buah Persea americana Mill. yang memiliki kemampuan untuk meningkatkan kadar albumin serum.

C. Bahan Penelitian 1.

Bahan utama a. Hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus jantan galur Wistar dengan berat badan 150 – 250 gram dan berumur 2 – 3 bulan yang diperoleh dari Laboratorium Imono Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. b. Bahan uji yang digunakan adalah kulit buah Persea americana yang diperoleh dari depot es Teller 77 di Ambarukmo Plaza Yogyakarta pada bulan Juni 2014.

2. Bahan kimia

a. Senyawa hepatotoksin yang digunakan adalah karbon tetraklorida yang diperoleh dari laboratorium kimia organik Fakultas Farmasi Sanata Dharma Yogyakarta. b. Pelarut senyawa hepatotoksin yang digunakan adalah Olive Oil merk Bertolli®. c. Kontrol negatif yang digunakan adalah Olive Oil merk Bertolli®. d. Pelarut untuk infusa digunakan aquadest yang diperoleh dari Laboratorium Farmakologi Toksikologi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. e. Blanko pengukuran aktivitas ALT yang digunakan pada orientasi waktu pencuplikan darah adalah aqua bidestilata yang diperoleh dari Laboratorium Kimia Analisis dan Instrumental Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. f. Reagen serum ALT Reagen serum yang digunakan dalam orientasi waktu pencuplikan darah hewan uji adalah reagen ALT DiaSys, yang di peroleh dari Alfa Kimia Yogyakarta. Komposisi dan konsentrasi dari reagen ALT adalah sebagai berikut. Tabel 1. Komposisi dan konsentrasi reagen serum ALT

D. Alat Penelitian

Alat-alat yang digunakan di dalam penelitian ini antara lain oven, mesin penyerbuk, ayakan, panci enamel, termometer, stopwatch, beaker glass, gelas ukur, cawan porselen, penangas air, kain flannel, tabung reaksi, labu ukur, pipet tetes, batang pengaduk, timbangan analitik Mettler Toledo®, sentrifuge, vortex, spuit injeksi per oral dan syringe 3 cc Terumo®, pipa kapiler, tabung Eppendorf, Microlab 200 Merck®, dan stopwatch.

E. Tata Cara Penelitian 1.

Determinasi serbuk kulit Persea americana Mill. Determinasi dilakukan dengan mencocokkan serbuk kulit Persea americana Mill. yang diperoleh dari depot es Teller 77 di AMbarukmo Plaza Yogyakarta dengan serbuk kulit Persea americana Mill. pembanding yang dilakukan secara makroskopis dan mikroskopis.

2. Pengumpulan bahan uji

Bahan uji yang digunakan adalah kulit buah Persea americana Mill. berwarna hijau, masih segar dan tidak busuk serta telah di pisahkan dari sisa- sisa daging buahnya.

3. Pembuatan serbuk kulit

Persea americana Mill. Kulit buah Persea americana Mill. dicuci bersih dan dipisahkan dari sisa daging buahnya. Setelah itu, kulit dirajang tipis lalu diangin – anginkan kemudian dikeringkan dalam oven pada suhu 50 C selama 24 jam. Setelah kulit benar-benar kering, kulit dihaluskan dan diayak dengan ayakan nomor 40.

4. Penetapan kadar air pada serbuk kering kulit buah

Persea americana Mill. Serbuk kering kulit buah Persea americana Mill. yang sudah diayak, dimasukkan sebanyak ± 5 gram ke dalam alat moisture balance kemudian diratakan. Bobot serbuk kering kulit tersebut ditetapkan sebagai bobot sebelum pemanasan bobot A, setelah itu dipanaskan pada suhu 105 C. Serbuk kering kulit buah Persea americana Mill. yang sudah dipanaskan ditimbang kembali dan dihitung sebagai bobot setelah pemanasan bobot B. Kemudian dilakukan perhitungan terhadap selisih bobot A terhadap bobot B yang merupakan kadar air serbuk kulit buah Persea americana Mill. Proses penetapan kadar air dilakukan oleh Laboratorium Penelitian dan Pegujian Terpadu Universitas Gadjah Mada LPPT UGM.

5. Pembuatan infusa kulit buah

Persea americana Mill. Infusa kulit buah Persea americana Mill. dibuat dengan konsentrasi 8 . Sebanyak 8 g serbuk kering kulit buah Persea americana Mill. dibasahi terlebih dahulu dengan 16 ml aquadest kemudian ditambahkan dengan 100,0 ml aquadest. Campuran ini kemudian dipanaskan diatas heater selama 15 menit dengan suhu 90 o C. Waktu 15 menit terhitung saat campuran mencapai suhu 90 o C . Setelah 15 menit, campuran tersebut diambil dan disaring menggunakan kain flannel kemudian tambahkan air panas secukupnya melalui ampas hingga diperoleh volume infusa kulit buah Persea americana Mill yang dikehendaki.

6. Pembuatan larutan karbon tetraklorida

Larutan karbon tetraklorida dibuat dengan perbandingan karbon tetraklorida : pelarut adalah 1:1, sehingga konsentrasi larutan karbon tetraklorida yang digunakan adalah 50 Janakat dan Al-Merie, 2002. Pelarut yang digunakan dalam pembuatan larutan ini adalah olive oil.

7. Uji Pendahuluan

a. Penetapan dosis hepatotoksik karbon tetraklorida Penetapan dosis karbon tetraklorida digunakan sebagai hepatotoksin mengacu pada penelitian Janakat dan Al-Merie 2002, Dosis karbon tetraklorida yang digunakan untuk menginduksi kerusakan hati pada tikus galur Wistar adalah 2 mLkgBB diberikan secara intraperitonial. Dosis ini mampu merusak sel-sel hati pada tikus jantan yang ditunjukkan melalui peningkatan aktivitas ALT namun tidak menimbulkan kematian pada hewan uji Wijayanti, 2013. b. Penetapan dosis infusa kulit buah Persea americana Mill. Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan oleh Putri, 2013, dosis infusa biji Persea americana Mill. dengan dosis 362,81; 761,90; 1600 mgkgBB memiliki efek hepatoprotektif terhadap kadar ALT-AST serum pada tikus terinduksi karbon tetraklorida. Peringkat dosis didasarkan pada pengobatan yang biasa digunakan pada masyarakat yaitu ± 2 sendok makan 4 g serbuk biji Persea americana Mill. yang direbus dengan 250 ml air. Maka dosis perlakuan yang digunakan adalah 4 g70 kgBB manusia. Konversi dosis tikus manusia 70 kg ke tikus 200g = 0,018. Dosis untuk 200 g tikus = 0,018 x 4g = 0,72 g200 g BB = 360 mgkgBB sebagai dosis rendah.Konsentrasi maksimal infusa biji Persea americana Mill. yang dapat dibuat adalah 8 g 100 ml, dengan asumsi berat badan hewan uji maksimal adalah 200 g, dan volume maksimal pemberian infusa secara p.o = 4 ml. Berdasarkan perhitungan : D x 200 g = 8 g 100ml x 4 ml D = 1600 mgkgBB, dosis ini disebut dosis tinggi perlakuan. Untuk mendapatkan dosis tengah perlakuan, terlebih dahulu dihitung faktor kelipatan dari dosis rendah dan dosis tinggi yang sudah diperoleh. Perhitungan faktor kelipatan adalah sebagai berikut : N = Jumlah peringkat dosis yang digunakan. Penelitian ini menggunakan 3 peringkat dosis maka n = 3, sehingga perhitungannya sebagai berikut : Berdasarkan faktor kelipatan yang diperoleh maka dosis tengah dan dosis rendah perlakuan ditentukan sebagai berikut, D = 1600 mg kgBB : 2,1 = 761,90 mg kgBB dosis tengah D = 761,90 mg kgBB : 2,1 = 362,81 mg kgBB dosis rendah Oleh karena itu peneliti menggunakan dosis yang sama untuk pemberian jangka panjang infusa kulit buah Persea americana Mill. yang diharapkan memiliki pengaruh terhadap kadar albumin tikus jantan galur Wistar terinduksi karbon tetraklorida. c. Penetapan waktu pencuplikan darah Penetapan waktu pencuplikan darah ditentukan melalui orientasi dengan tiga kelompok perlakuan waktu, yaitu pada jam ke–0, 24, dan 48 setelah pemejanan karbon tetraklorida. Setiap kelompok perlakuan terdiri dari 5 hewan uji yang pengambilan darahnya dilakukan melalui pembuluh sinus orbitalis mata kemudian diukur aktivitas ALT.

8. Pengelompokkan dan perlakuan hewan uji

Hewan uji yang dibutuhkan sebanyak 30 ekor tikus jantan galur Wistar yang dibagi secara acak dalam 6 kelompok sama banyak. Kelompok I kelompok kontrol hepatotoksin diberi karbon tetraklorida dosis 2 mLkgBB yang dilarutkan dalam olive oil secara intraperitonial. Kelompok II kelompok kontrol negatif diberi olive oil sebanyak 2 mLkgBB secara intraperitonial. Kelompok III kelompok kontrol infusa diberi infusa kulit buah Persea americana Mill. dosis tinggi 1600 mgkgBB secara per oral setiap hari secara berturut-turut selama 6 hari, kemudian diambil darahnya. Kelompok IV, V, dan VI kelompok perlakuan diberi infusa kulit buah Persea americana Mill. dengan seri dosis 1600; 761,90; dan 326,81 mgkgBB satu kali sehari selama 6 hari secara berturut-turut pada jam yang sama secara per oral, kemudian setelah pemberian infusa kulit buah Persea americana Mill. dilakukan pemberian karbon tetraklorida dosis 2 mLkgBB. Pada jam ke-24 setelah pemberian karbon tetraklorida, semua kelompok diambil darahnya pada daerah sinus orbitalis mata untuk penetapan kadar albumin.

9. Pengukuran kadar albumin

Pengukuran kadar albumin serum dilakukan di Laboratorium Parahita, Yogyakarta. Kadar albumin dinyatakan dalam satuan mgdL.

F. Tata Cara Analisis Hasil

Kadar albumin pada perlakuan diuji dengan Kolmogorov-Smirnov untuk mengetahui distribusi data tiap kelompok hewan uji. Apabila didapat distribusi data yang normal maka analisis dilanjutkan dengan analisis pola searah One Way ANOVA dengan taraf kepercayaan 95 untuk mengetahui perbedaan masing- masing kelompok. Kemudian dilanjutkan dengan uji Scheffe untuk melihat perbedaan masing-masing antar kelompok bermakna signifikan p0,05 atau tidak bermakna tidak signifikan p0,05. 30

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian jangka panjang infusa kulit buah Persea americana Mill. terhadap peningkatan kadar albumin pada tikus jantan galur Wistar yang terinduksi karbon tetraklorida. Pada penelitian ini juga akan dilihat apakah ada atau tidaknya kekerabatan antara peningkatan dosis infusa kulit buah Persea americana Mill. dengan peningkatan kadar albumin pada tikus jantan galur Wistar yang terinduksi karbon tetraklorida. Hasil penelitian yang akan dibahas adalah sebagai berikut determinasi kulit Persea americana Mill., penetapan kadar air serbuk kulit buah Persea americana Mill., pemeriksaan kadar albumin serum.

A. Determinasi Kulit Buah Persea americana Mill.

Tahap awal penelitian ini adalah melakukan pemeriksaan terhadap kulit buah Persea americana Mill. yang diperoleh dari depot es Teller 77 di Ambarukmo Plaza Yogyakarta pada bulan juni 2014 melalui determinasi. Determinasi ditujukan untuk memastikan bahwa serbuk Persea americana Mill. yang digunakan pada penelitian ini adalah benar Persea americana Mill. Determinasi tersebut dilakukan dengan mencocokkan ciri-ciri makroskopis dan mikroskopis serbuk uji pembandingnya yang dibuat mandiri di laboratorium Farmakognosi Fitokimia Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma. Hasil determinasi ini diperoleh bukti bahwa serbuk Persea americana Mill. yang peneliti gunakan dalam penelitian tersebut adalah benar Persea americana Mill.