19
II. METODOLOGI PENELITIAN
A. Bahan dan Alat Penelitian
Bahan-bahan yang digunakan adalah minyak sawit merah netral neutralized deodorized red palm oilNDRPO dari SEAFAST Center IPB,
minyak kelapa coconut oilCNO merk Barco, lipase Thermomyces lanuginosa
imobil spesifik sn-1,3 Lipozyme TL IM, dan lipase Candida antartica
imobil non-spesifik Novozyme 435. Bahan-bahan untuk analisis kimia adalah heksana p.a., etanol 95
netral, indikator fenoftalein 1, NaOH 0.25 N, aseton, gas N
2
, dan air destilata. Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah shaker, sentrifus,
nuclear magnetic resonance
NMR
, spektrofotometer, refrigerator, timbangan analitik, oven, hot plate, desikator, termometer, labu ukur, corong,
erlenmeyer, cawan alumunium, stirer, vortex, filter 0.45 µm, buret, kertas putih, kertas tissue, pengelim plastik, label kertas, kertas saring, dan alat-alat
gelas untuk analisis.
B. Metode Penelitian
Penelitian ini dibagi menjadi tiga tahap. Penelitian tahap pertama yaitu karakterisasi bahan baku. Penelitian tahap kedua yaitu pemilihan formula
bahan baku, sedangkan penelitian tahap ketiga yaitu pengaruh kecepatan agitasi dan lama reaksi terhadap karakteristik produk bahan baku spreads hasil
interesterifikasi enzimatik minyak sawit merah.
1. Penelitian Tahap Pertama: Karakterisasi Bahan Baku
Penelitian tahap pertama bertujuan untuk mengetahui kondisi awal dari bahan baku sehingga dapat diketahui peluangnya untuk proses
interesterifikasi enzimatik. Sebelum karakterisasi, dilakukan terlebih dahulu proses fraksinasi dan formulasi. Proses fraksinasi dilakukan
terhadap NDRPO untuk mendapatkan red palm olein RPO dan red palm stearin
RPO. Proses fraksinasi pada penelitian tahap ini menggunakan
20 metode Aini et al. 2005 yang dimodifikasi Hasrini 2008. Proses
fraksinasi dapat dilihat pada Gambar 3.
Gambar 3 . Diagram proses fraksinasi modifikasi Aini et al., 2005
Prosedur lengkapnya yaitu NDRPO dipanaskan pada suhu 60 selama 30 menit, lalu NDRPO tersebut dipindahkan ke dalam tabung
sentrifus 50 ml dan didiamkan semalam ±16 jam. Pemisahan RPO dan RPS dilakukan dengan sentrifus pada kecepatan 2500 rpm selama 25
menit. Setelah proses fraksinasi, dilakukan proses formulasi terhadap RPO, RPS, dan CNO. Proses formulasi dilakukan dengan cara
mencampurkan RPORPO 1:1 dan CNO dengan rasio 75:25, 77.5:22.5, dan 82.5:17.5. Karakteristik yang dianalisis pada penelitian tahap ini
adalah total karoten, slip melting point, solid fat content, kadar air, dan asam lemak bebas.
2. Penelitian Tahap Kedua: Pemilihan Formula Bahan Baku
Penelitian tahap kedua bertujuan untuk memilih satu formula bahan baku. Pemilihan formula bahan baku dilakukan terhadap tiga formula hasil
penelitian Hasrini 2008 yang menghasilkan karakter fisik paling mendekati margarin ritel dan industri. Enzim yang digunakan pada
NDRPO
Sentrifugasi V=2500 rpm, 25 menit Pemindahan ke tabung sentrifus 50 ml
RPO RPO
Pemanasan T= 60
o
C, 30 menit
Penyimpanan di tempat gelap semalam, T ruang
21 penelitian tahap ini adalah Lipozyme TL IM. Prosedur interesterifikasi
enzimatik menggunakan metode Zhang et al. 2001 yang dimodifikasi Hasrini 2008. Prosedur kerja interesterifikasi enzimatik dapat dilihat
pada Gambar 4
Gambar 4 . Prosedur interesterifikasi enzimatik modifikasi Zhang et al.,
2001 Prosedur lengkapnya yaitu RPORPS 1:1 ditambahkan CNO
masing-masing dengan rasio sesuai perlakuan sebanyak 10 g. Sampel tersebut lalu dimasukkan ke dalam tabung erlenmeyer 25 ml, diagitasi
dengan menggunakan shaker pada kecepatan 200 rpm dan suhu 60 . Setelah mencapai suhu 60 dan sampel telah meleleh sempurna,
kemudian dimasukkan enzim Lipozyme TL IM sebanyak 10 bb dan diagitasi kembali selama 4 jam. Hasil interesterifikasi tersebut diangkat
dan Lipozyme TL IM disaring. Sampel kemudian disimpan dalam botol kaca gelap, dihembus N
2
, ditutup dan disimpan dalam refrigerator. Analisis yang dilakukan terhadap produk hasil interesterifikasi enzimatik
adalah total karoten, slip melting point, dan solid fat content. Tiga formula bahan baku yang digunakan dalam interesterifikasi enzimatik dapat dilihat
pada Tabel 9.
Hasil interesterifikasi enzimatik Agitasi selama 4 jam V= 200 rpm, T= 60ºC
Penyaringan enzim Penambahan enzim Lipozyme TL IM 10 bb
Agitasi sampai suhu mencapai 60ºC V= 200 rpm Pemasukan ke dalam erlenmeyer
Penambahan CNO sesuai perlakuan RPORPS 1:1
22
Tabel 9 . Formula bahan baku
Sampel Kode Sampel
RPORPS 1:1:CNO 75:25
M75 77.5:22.5 M77
82.5:17.5 M82
3. Penelitian Tahap Ketiga: Pengaruh Kecepatan Agitasi dan Lama
Reaksi terhadap Karakteristik Produk Bahan Baku Spreads Hasil
Interesterifikasi Enzimatik Minyak Sawit Merah.
Penelitian tahap ketiga bertujuan untuk melihat pengaruh kecepatan agitasi dan lama reaksi terhadap karakteristik produk hasil interesterifikasi
enzimatik. Satu formula bahan baku dari penelitian tahap kedua digunakan sebagai formula terpilih pada penelitian tahap ketiga. Tahapan kerja
interesterifikasi enzimatik dapat dilihat pada Gambar 5.
Gambar 5 . Prosedur interesterifikasi enzimatik modifikasi Zhang et al.,
2001 Prosedur lengkapnya yaitu RPORPS 1:1 ditambahkan CNO sesuai
perlakuan sebanyak 15 g. Sampel tersebut lalu dimasukkan ke dalam tabung erlenmeyer 25 ml, diagitasi dengan menggunakan shaker pada
Penambahan CNO sesuai perlakuan RPORPS 1:1
Penambahan enzim Novozyme 435 10 bb Agitasi sampai suhu mencapai 60 ºC V= 100, 200 rpm
Pemasukan sampel ke dalam erlenmeyer
Agitasi selama 0, 1, 2, 4, 8, 16, 24 jam V= 100, 200 rpm, T= 60
Hasil interesterifikasi enzimatik Penyaringan enzim
23 kecepatan sesuai perlakuan dan suhu 60 . Setelah mencapai suhu 60
dan sampel telah meleleh sempurna, kemudian dimasukkan enzim Novozyme 435 sebanyak 10 bb dan diagitasi kembali sesuai dengan
lama reaksi yang telah ditentukan. Hasil interesterifikasi tersebut diangkat dan Novozyme 435 disaring. Sampel kemudian disimpan dalam botol kaca
gelap, dihembus N
2
, ditutup, dan disimpan dalam refrigerator. Analisis yang dilakukan pada tahap ini adalah total karoten, slip melting point,
solid fat content , kadar air, dan asam lemak bebas.
Kecepatan agitasi yang digunakan pada tahap ini adalah 100 dan 200 rpm, sedangkan lama reaksi yang digunakan adalah 0, 1, 2, 4, 8, 16, dan
24 jam. Sampel dengan lama reaksi 0 jam merupakan sampel yang tidak mengalami reaksi interesterifikasi enzimatik
initial mixtures . Perlakuan
kecepatan agitasi dan lama reaksi dapat dilihat pada Tabel 10. Tabel 10
. Perlakuan kecepatan agitasi dan lama reaksi Kecepatan agitasi rpm
Lama reaksi jam Kode sampel
100 0 A0
1 A1 2 A2
4 A4 8 A8
16 A16 24 A24
200 0 B0
1 B1 2 B2
4 B4 8 B8
16 B16 24 B24
24
C. Metode Analisis
Metode analisis yang digunakan untuk menganalisis total karoten, slip melting point
, solid fat content, kadar air, dan kadar asam lemak bebas adalah:
1. Total Karoten PORIM p2.6, 1995
Sampel dilelehkan dan dihomogenasi. Kemudian sampel sebanyak 0.1 g dilarutkan dengan heksana p.a. ke dalam labu takar 25 ml sampai
tanda tera, lalu dikocok hingga benar-benar homogen. Selanjutnya absorbansi diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 446
nm. Total karotenoid dihitung dengan menggunakan rumus:
Total karotenoid ppm 5 x 8 x absorbansi
Berat sampel g x
2. Slip Melting Point SMP AOCS Official Method Cc 3-25, 1990
Pipa kapiler yang berdiameter 1 mm dan panjang 10 cm dicelupkan dalam sampel minyak yang sudah dipanaskan setinggi ± 1 cm, lalu bagian
luar pipa kapiler dibersihkan dengan tissue. Pipa kapiler disimpan dalam refrigerator
suhu 4-10 ºC selama 16 jam semalam. Kemudian
dipasangkan pada termometer dengan diikat karet sejajar dengan ujung termometer. Termometer dicelupkan ke dalam gelas piala di atas hot plate
berisi air dengan suhu 8-10 di bawah SMP sampel. Hot plate dinyalakan
dengan kenaikan suhu 1 per menit. Air dalam gelas piala naik suhunya,
pada suhu tertentu sampel minyak dalam kapiler mencair yang ditandai dengan naiknya sampel tersebut. Selang suhu termometer saat sampel
minyak mulai naik sampai sampel minyak berada di atas batas 1 cm dicatat.
3. Solid Fat Content SFC IUPAC 2.150 ex 2.323, 1987
Pengukuran SFC dilakukan menggunakan alat nuclear magnetic resonance
NMR Brucker Minispec PC 100 NMR Analyzer. Pre-
25 treatment
atau prosedur stabilisasi sangat menentukan jumlah dan tipe kristal lemak yang terbentuk, dan konsekuensinya terhadap kandungan
padatan solid content yang diukur dengan NMR. Prosedur stabilisasi dan tempering untuk pengukuran SFC margarin, sesuai dengan yang
dikeluarkan oleh Bruker Typical Applications for Industry: Minispec Application Note 8
. Sampel diisikan ke dalam tabung NMR setinggi ± 2,5 cm. Sebelum
dianalisis, sampel dipanaskan pada suhu 80 agar meleleh sempurna
untuk meyakinkan homogenitasnya. Kemudian sampel yang telah meleleh dipertahankan pada suhu 60 selama 5 menit. Selanjutnya sampel
disimpan pada suhu 0 selama 60 menit. Sebelum dianalisis SFC, sampel dipertahankan dulu pada masing-masing suhu pengukurannya yaitu 10, 20,
25, 30, 35, dan 40
o
C selama 30-35 menit.
4. Kadar Air AOAC, 1995
Sejumlah ± 5.0 g sampel dimasukkan ke dalam cawan yang telah diketahui beratnya. Kemudian cawan dimasukkan ke dalam oven bersuhu
100
o
C hingga diperoleh berat yang konstan. Perhitungan kadar air dilakukan dengan menggunaan rumus:
Kadar air = x 100
Keterangan : a = berat cawan dan sampel g b = berat cawan dan sampel akhir g
c = berat sampel awal g
5. Kadar Asam Lemak Bebas AOCS Official Method Ca 5a-40, 1990
Sampel sebanyak 7.05 ± 0.05 g dilarutkan dalam 75 ml alkohol 95 netral, dipanaskan selama 10 menit dalam hot plate sambil diaduk, lalu
ditambahkan 3-5 tetes indikator fenoftalein 1. Setelah itu sampel tersebut dititrasi dengan larutan standar NaOH 0.25 N hingga warna merah
26 muda tetap. Asam lemak bebas dinyatakan sebagai persen asam lemak,
dihitung sampai dua desimal dengan menggunakan rumus:
Kadar asam lemak bebas =
Keterangan: M= Bobot molekul asam lemak 269.74 untuk minyak sawit, 266.38 untuk fraksi stearin minyak sawit, 270.54 untuk
fraksi olein minyak sawit, dan 212.23 untuk minyak kelapa
V= Volume NaOH yang diperlukan dalam peniteran ml T= Normalitas NaOH N
m= Bobot contoh g
D. Analisis Data
Data total karoten, slip melting point SMP, kadar air, dan asam lemak bebas yang diperoleh dari penelitian tahap kedua dan penelitian tahap ketiga
diuji secara statistik. Pengolahan data untuk uji statistik menggunakan program SPSS 12.0. Data yang diperoleh terlebih dahulu dilakukan analisis
ragam dengan ANOVA untuk mengetahui apakah data tersebut berbeda nyata. Setelah diketahui bahwa data yang diperoleh berbeda nyata, selanjutnya
dilakukan uji lanjut Duncan. Hasil uji lanjut Duncan menunjukkan antar data mana yang sebenarnya berbeda nyata Lea et al., 1997.
27
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Penelitian Tahap Pertama: Karakterisasi Bahan Baku
Karakterisasi dilakukan untuk mengetahui kondisi awal dari bahan baku sehingga dapat diketahui peluangnya untuk proses interesterifikasi enzimatik.
Sebelum karakterisasi, dilakukan terlebih dahulu proses fraksinasi dan formulasi. Proses fraksinasi dilakukan terhadap neutralized deodorized red
palm oil NDRPO untuk mendapatkan red palm olein RPO dan red palm
stearin RPS. Proses formulasi dilakukan dengan cara mencampurkan
RPORPS 1:1 dan coconut oil CNO dengan rasio 75:25, 77.5:22.5, dan 82.5:17.5. Karakteristik bahan baku yang dianalisis adalah total karoten, slip
melting point , solid fat content, kadar air, dan asam lemak bebas. Hasil
analisis terhadap karakteristik tersebut terdapat pada Lampiran 1. 1.
Total Karoten
Minyak sawit merah merupakan sumber yang kaya karoten alami. Menurut Naibaho 1990, minyak sawit merah mengandung total karoten
600–1000 ppm dengan persentase α-karoten 36.2, β-karoten 54.4, δ-
karoten 3.3, likopen 3.8, dan xantofil 2.2. Hasil analisis total karoten
dari bahan baku ditunjukkan pada Tabel 11. Tabel 11.
Total karoten dari bahan baku Sampel
Kode sampel Total karoten ppm
NDRPO 376.47 ± 3.65
RPO 351.36 ± 12.07
RPORPS 343.27 ± 7.89
RPORPS:CNO 75:25
M75 262.42 ± 6.80
77.5:22.5 M77
265.01 ± 12.66 82.5:17.5
M82 269.02 ± 8.73
Keterangan: Data ± Standar deviasi; NDRPO= Neutralized deodorized red palm oil; RPO= Red palm olein; RPS= Red palm stearin; CNO= Coconut oil.
Total karoten NDRPO lebih tinggi dari total karoten RPO dan RPORPS. Hal ini diduga karena adanya pemanasan sebelum proses