26 dibandingkan menggunakan pelarut etil asetat semi polar dan heksana non
polar, hal ini disebabkan pelarut metanol dapat memecah sel dan mengekstrak
bahan sampai ke bagian dalam sel.
Menurut Sukardiman et al. 2002, pelarut metanol adalah pelarut yang dapat melarutkan seluruh kandungan kimia dari sampel yang bersifat polar
maupun non polar, karena komponen-komponen tersebut saling terkait satu dengan lainnya melalui gugus fungsional sehingga komponen kimia yang ada
pada sampel tanaman obat dapat tersari secara sempurna. Urutan hasil rendemen X. granatum dari beberapa bagian tanaman dengan menggunakan pelarut metanol
dari yang terkecil, yaitu: daging buah 3.97; daun 6.75; akar 12.54 biji 15.60 dan batang 22.42.
Pemilihan pelarut dalam proses ekstraksi harus memperhatikan sifat kandungan kimia bahan yang akan diekstrak. Dengan mengetahui sifat metabolit
yang akan diekstrak dapat dipilih pelarut yang sesuai berdasarkan kepolaran zatnya. Menurut Bruneton 1993, alkaloid sebagai basa larut dalam pelarut non
polar seperti heksana dan kloroform. Selanjutnya menurut Harbonne 1987, etil asetat mampu mengekstrak senyawa fenol dan terpenoid sedangkan metanol
mampu mengekstrak senyawa alkaloid kuartener, komponen fenolik, karotenoid
dan tanin.
Selesai ekstraksi, proses dilanjutkan dengan pembersihan ekstrak yang bertujuan untuk menghilangkan pengotor yang dapat menghambat pemurnian.
Residu yang diperoleh antara lain berupa lemak, lilin dan lain-lain.
4.2. Aktivitas Inhibitor Topoisomerase I
Aktivitas inhibisi dari ekstrak tanaman ditandai dengan adanya perubahan bentuk supercoiled DNA dari substrat menjadi bentuk relaxed DNA,
dimana pita dari DNA hasil reaksi dapat dicocokan dengan pita DNA dari marker. Pengujian aktivitas inhibitor topoisomerase I dilakukan untuk semua bagian
tanaman X. granatum yaitu ekstrak akar, batang, daun, biji dan daging buah dalam pelarut heksana, etil asetat dan metanol. Hasil uji topoisomerase I menunjukkan
ekstrak kasar X. granatum pada konsentrasi 50 gml dapat menghambat enzim topoisomerase I, kecuali pada ekstrak akar heksana tidak dapat menghambat
27 enzim topoisomerase I. Uji inhibisi enzim DNA topoisomerase I dari ekstrak
kasar X. granatum disajikan pada Tabel 4 dan Gambar 15. Tabel 4 Uji inhibisi enzim DNA topoisomerase I dari ekstrak kasar
X. granatum 50 gml Jenis sampel kering
Jenis pelarut Inhibisi topoisomerase I
heksana -
etil asetat poison : +
1. Akar metanol
katalitik : +
heksana poison : +
etil asetat poison : +
2. Batang metanol
katalitik : +
heksana poison : +
etil asetat poison : +
3. Daun metanol
poison : +
heksana katalitik : +
etil asetat poison : +
4. Daging buah metanol
katalitik : +
heksana poison : +
etil asetat poison : +
5. Biji metanol
katalitik : +
Gambar 15 Hasil elektroforesis uji inhibisi enzim DNA topoisomerase I ekstrak kasar X. granatum pada konsentrasi 50 gml
Topoisomerase I Drug Screening Kit dari TopoGen dapat mendeteksi senyawa pada ekstrak yang bersifat poison yaitu mampu menstabilkan
ikatan enzim dan substrat nicked intermediate yang diindikasikan dengan peningkatan open circular OC DNA pada gel, seperti ditunjukkan pada kontrol
sumur no 5 Topo I + DNA + camptothecin. Ekstrak kasar X. granatum yang bersifat poison yaitu ekstrak etil asetat akar no 7a, ekstrak heksana dan etil asetat
batang no 6b dan 7b, ekstrak heksana, etil asetat dan metanol daun no 6c, 7c
Keterangan : 1. Topo I + DNA, 2. Marker supercoiled DNA, 3. Topo I + DNA + pelarut, 4. Marker relaxed DNA, 5. Topo I + DNA + camptothecin, 6. Ekstrak heksana, 7. Ekstrak
etil asetat, 8. Ekstrak metanol, a akar, b batang, c daun, d daging buah, e biji
1 2
3 4
5 6a b c
d 7a
e b c
d e
8a b c
d e
28 dan 8c, ekstrak etil asetat daging buah no 7d, ekstrak heksana dan etil asetat
biji no 6e dan 7e. Senyawa pada ekstrak bersifat katalitik ditunjukkan dengan dihambatnya aktivitas relaksasi yang ditandai tetap utuhnya substrat, tetap
berbentuk supercoiled DNA atau tidak terbentuk relaxed DNA, seperti ditunjukkan pada kontrol sumur no 2 marker supercoiled DNA. Ekstrak kasar
X. granatum yang bersifat katalitik yaitu ekstrak metanol akar dan batang no 8a dan 8b, ekstrak heksana dan metanol daging buah no 6d dan 8d, serta ekstrak
metanol biji no 8e. Sedangkan ekstrak heksana akar tidak dapat menghambat enzim topoisomerase I, terlihat dengan terbentuknya relaxed DNA seperti kontrol
no 1 Topo I + DNA dan kontrol no 4 marker relaxed DNA. Jenis pengujian inhibitor topoisomerase I pada ekstrak X. granatum adalah
prescreen test yaitu untuk mengetahui apakah suatu senyawa merupakan senyawa bioaktif, dengan mekanisme penghambatan langsung membunuh sel kanker secara
in vitro. Menurut Sukardiman et al. 2002, senyawa yang memiliki hambatan
terhadap aktivitas enzim DNA topoisomerase sebagian besar menyebabkan kematian sel kanker dengan cara menginduksiapoptosis dimana sel kanker akan
mati dengan memakan sesama sel kanker, sehingga pada aplikasi kliniknya nanti diharapkan akan lebih selektif yaitu hanya membunuh sel kankernya saja tanpa
membunuh sel normal. Menurut Putri 2004, salah satu cara untuk menguji kemampuan inhibisi
suatu senyawa terhadap topoisomerase I yaitu dengan menguji kemampuan senyawa itu dalam menghambat pertumbuhan S. cerevisiae. Selanjutnya menurut
Dewick 2001, golongan alkaloid yaitu irinotecan dan camptothecin dapat menghambat pertumbuhan S. cerevisiae dengan mekanisme kerja sebagai
inhibitor enzim topoisomerase I, yaitu dengan cara mengikat dan menstabilkan komplek kovalen DNA-topoisomerase.
Sutaryadi 1991 menyatakan bahwa golongan alkaloid yang bersifat antitumor antara lain pirosilisin, isokinolin,
benzofenantridin, indol, sefalotaksus dan camptothecin. Akiyama 1987 menyatakan genistein merupakan golongan flavonoid
yang banyak digunakan sebagai standar dalam menganalisis inhibitor dari tirosin kinase. Menurut Murakani et al. 1999, quarsetin dan kaemferol termasuk
golongan flavonoid yang terdapat pada ekstrak lengkuas merah, digunakan
29 sebagai senyawa antikanker. Selanjutnya menurut Mangan 2003, quarsetin
berfungsi menghambat proliferasi sel leukimia dan sel ovari manusia secara in vitro.
4.3. Pengujian Fitokimia Ekstrak Kasar Metanol X. granatum
