21 3
ekstrak yang diperoleh dicuci ulang dengan menambahkan pelarutnya kembali dan langkah selanjutnya sama dengan pencucian pertama, pencucian
dilakukan minimal 3 kali,
3.3.3. Pengujian aktivitas inhibitor topoisomerase I
Ekstrak X. granatum akar, batang, daun, daging buah dan biji dalam pelarut heksana, etil asetat dan metanol dilakukan uji inhibisi enzim DNA
topoisomerase I. Pengujian antikanker secara in vitro bertujuan untuk melihat kemampuan sitotoksik ekstrak dalam menghambat enzim DNA topoisomerase I.
Prosedur pengujian aktivitas inhibitor topoisomerase I disajikan pada Lampiran 2 dan visualisasi gel agarose dengan marker serta kontrol pada Lampiran 3.
3.3.4. Pengujian fitokimia
Uji fitokimia merupakan salah satu cara untuk mengetahui kandungan metabolit sekunder pada suatu ekstrak tanaman atau merupakan uji pendahuluan
untuk mengetahui keberadaan senyawa kimia spesifik seperti senyawa alkaloid, fenol termasuk flavonoid, tanin, dan saponin. Prinsip dan prosedur pengujian
alkaloid, flavonoid, tanin dan saponin disajikan pada Lampiran 4.
3.3.5. Pengujian antibakteri
Pengujian aktivitas antibakteri ekstrak metanol X. granatum akar, batang, daun, daging buah dan biji terdiri dari tahap persiapan dan pembuatan media,
penyegaran bakteri uji dan uji aktivitas antibakteri. Metode yang digunakan pada pengujian aktivitas antibakteri adalah metode difusi agar dengan teknik agar
tuang. Prinsip metode ini, yaitu ekstrak akan berdifusi langsung dalam media agar yang telah mengandung bakteri uji. Bakteri uji yang digunakan adalah S.
aureus bakteri Gram positif dan E. coli bakteri Gram negatif. Uji aktivitas antibakteri ekstrak metanol X. granatum pada Gambar 11 dan tahapan pengujian
antibakteri disajikan pada Lampiran 5.
22
Divortex hingga homogen Dimasukkan dalam cawan
petri
Dibiarkan memadat ±
15 menit Disimpan dalam pendingin 30 menit
Penambahan ekstrak 20 µ
l 300
µ g paper disc,
kloromfenikol 10 µ
gpaper disc, ampisilin 25
µ gpaper disc
Diinkubasi pada suhu 37
O
C 12-18 jam Disimpan dalam lemari
Pendingin 30 menit
Pengamatan dengan mengukur Zona bening yang terbentuk
Paper disc diletakkan pada cawan petri berisi bakteri
Bakteri sebanyak 20 µ
l, OD
600 nm
= 0.68 S. aureus dan 0.59 E. coli, dimasukan dalam 15 ml media agar
Gambar 11 Pengujian aktivitas antibakteri Schlegel dan Schmidt 1994
3.3.6. Penapisan ekstrak kasar
Penapisan ekstrak kasar metanol batang X. granatum untuk target pemurnian senyawa kimia, dengan metode spesifik yaitu penggunaan pelarut
yang tepat dengan tujuan untuk menghilangkan komponen pengotor dan mendapatkan fraksi murni.
Pemurnian atau isolasi senyawa target untuk memperoleh senyawa yang memiliki bioaktifitas terbaik dari 3 golongan senyawa target yaitu
alkaloid, flavonoid dan tanin. Alasan pemilihan metode isolasi spesifik karena kesulitan mendapatkan eluen yang cocok untuk memisahkan ekstrak dengan
metode kromatografi lapis tipis dan kolom serta fraksinasi dengan metode ini
23 memerlukan waktu isolasi yang lama. Diagram alir penapisan, pemurnian
alkaloid, flavonoid dan tanin ekstrak metanol batang X. granatum disajikan pada Gambar 12, 13 dan 14.
Ekstrak kasar Maserasi selama 24 jam dalam metanol dan air 4:1
Penyaringan Filtrat
Evaporasi suhu 40
o
C sampai 110 volume awal Pengasaman dengan asam sulfat 2M pH 3-4
Ekstraksi 3x dengan kloroform Lapisan kloroform
Lapisan air-asam Evaporasi
Pembasaan dengan amoniak pH 10 Ekstrak pertengahan polar
Ekstraksi 2x EPPFraksi alkaloid kloroform-metanol 3:1
Lapisan kloroform dan metanol Lapisan air-basa Evaporasi Ekstraksi
dengan metanol Ekstrak basaEB
Ekstrak polarEP Gambar 12 Penapisan ekstrak kasar Harborne 1987 dan
Pemurnian alkaloid Martono 1983
24 Ekstrak metanol batang
Pelarutan dengan akuades panas Penyaringan
Residu Filtrat
Partisi dengan heksana Partisi dengan kloroform
Partisi dengan etanol Partisi dengan etil asetat
Partisi dengan butanol Fraksi butanol
Fraksi flavonoid Evaporasi Gambar 13 Pemurnian flavonoid Budzianowski 1985
Ekstrak metanol batang Partisi dengan heksana
Fraksi heksana Ekstraksi dengan
aseton dan air 7:3 + asam askorbat 0,1 Filtrat Residu
Evaporasi Ekstrak
Partisi dengan kloroform Partisi dengan etil asetat
Fraksi etil asetat Evaporasi Fraksi tanin Gambar 14 Pemurnian tanin Makker dan Becker 1995
4. HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1. Ekstraksi X. granatum
Ekstraksi terhadap bahan tanaman bertujuan untuk memisahkan senyawa bioaktif tanaman biasanya dari senyawa tunggal atau kelompok senyawa.
Sebelum dilakukan proses ekstraksi sampel dikecilkan ukurannya untuk memudahkan kontak dengan pelarut sehingga diharapkan semakin banyak
senyawa bioaktif yang dapat terekstrak. Sampel X. granatum yang telah mengalami pengecilan ukuran disajikan pada Lampiran 6.
Rendemen merupakan perbandingan berat ekstrak yang diperoleh dengan berat awal sampel yang digunakan. Rendemen menyatakan efektivitas pelarut
tertentu terhadap bahan dalam suatu sistem ekstraksi, tetapi tidak menunjukkan tingkat aktivitas ekstrak tersebut. Hasil ekstraksi akar, batang, daun, biji dan
daging buah X. granatum dalam pelarut heksana, etil asetat dan metanol disajikan pada Tabel 3 dan filtrat yang diperoleh pada Lampiran 7.
Tabel 3 Hasil ekstraksi X. granatum Jenis sampel
berat kering Pelarut
Jumlah pelarut
ml Berat
ekstrak gram
Rendemen Warna filtrat
heksana 150 0.08
0.15 kuning
muda etil asetat
150 0.18
0.36 hijau muda
1. Akar 50 gram
metanol 150
6.27 12.5
merah tua pekat heksana 150
0.23 0.46
hijau pucat
etil asetat 150
0.60 1.20
hijau 2. Batang
50 gram metanol
150 11.21
22.42 merah tua pekat
heksana 150 0.64
1.28 hijau
muda etil asetat
150 0.69
1.37 hijau tua
3. Daun 50 gram
metanol 150
3.38 6.75
hijau tua pekat heksana 75
0.25 0.49
hijau pucat
etil asetat 75
0.81 1.61
hijau gelap 4. Biji
50 gram metanol 75
7.80 15.60
merah tua
heksana 75 0.27
0.54 coklat
etil asetat 75
0.15 0.29
coklat kemerahan 5. Daging
buah 50 gram
metanol 75 1.99
3.97 merah
tua
Tabel 3 menunjukkan bahwa berat ekstrak yang diperoleh dipengaruhi oleh jenis pelarut yang digunakan. Menurut Markham 1988, komponen yang
terbawa pada proses ekstraksi adalah komponen yang berpolaritas sesuai dengan pelarutnya. Jenis pelarut yang digunakan mempengaruhi jumlah rendemen
yang dihasilkan. Rendemen ekstrak metanol polar didapatkan lebih besar
