13
METODE PENELITIAN
A. BAHAN DAN ALAT
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari kultur bakteri asam laktat isolat ASI yang berasal dari koleksi SEAFAST Center IPB, de Mann Rogosa Sharpe Broth
MRSB Oxoid, de Mann Rogosa Sharpe Agar MRSA Oxoid, akuades, natrium tioglikolat Sigma, kolesterol murni 95 Sigma, oxgall Merck, etanol Merck, 2-propanol Merck,
KOH Merck, n-hexan Merck, gas nitrogen, asam asetat glasial Merck, o-ftalaldehida Sigma, H
2
SO
4
pekat Merck, sodium taurodeoksikolat Sigma, CaCl
2,
NaCl Merck, HCl 37 Merck, ungu kristal, lugol, dan safranin. Bakteri asam laktat isolat ASI yang digunakan berjumlah 37
isolat, yang terdiri dari 34 isolat homofermentatif dan 3 isolat heterofermentatif. Isolat homofermentatif yang digunakan terdiri atas Lactobacillus A3, A6, A7, A11, A13, A25, A27,
A30, A32, A38, B2, B10, B13, B16, R19-a2, R27, dan R32, Lactobacillus fermentum A20, Lactobacillus fermentum2 B11, Lactobacillus acidophilus1 A8 dan A22 Lactobacillus
rhamnosus A15, A23, A24, A29, R12, R14, R21, R22, R23, R24, R26, dan R34; Pediococcus pentosaceus2 A16, sedangkan isolat heterofermentatif terdiri atas Lactobacillus R3 dan
Leuconostoc R1 dan R9. Alat-alat yang digunakan terdiri atas peralatan gelas, neraca analitik, rak tabung reaksi,
sudip, mikropipet, magnetic stirrer, tip, pipet mohr, bulb, sentrifuse, tabung sentrifuse, alumunium foil, membran filter steril 0.2 µl, autoklaf, bunsen, vortex, inkubator 37ºC, penangas air 60ºC,
refrigerator, hot plate, ruang asam, termometer, pH-meter, anoxomat, dan spektrofotometer.
B. METODE PENELITIAN
Penelitian ini terdiri dari 4 tahap yang meliputi pengujian pertumbuhan BAL dalam media yang mengandung senyawa uji, pengujian ketahanan terhadap pH rendah dan garam empedu,
pengujian kemampuan mengasimilasi kolesterol, serta pengujian aktivitas BSH pada BAL. Diagram alir tahapan penelitian dapat dilihat pada Gambar 4.
1. Pemeliharaan Kultur Dewanti-Hariyadi
et al. 2003
Dalam penelitian ini dilakukan pemeliharaan terhadap kultur yang digunakan, yang meliputi penyegaran dan pengawetan kultur. Kultur yang digunakan dalam penelitian ini
berupa kultur terimobilisasi pada manik-manik. Oleh karena itu, kultur harus disegarkan terlebih dahulu.
Sebanyak kurang lebih 3 buah manik-manik dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi 10 ml MRSB steril, kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Selanjutnya dari
tabung reaksi berisi kultur tersebut diambil sebanyak 0.1 ml dan dimasukan ke dalam tabung reaksi lain yang berisi 10 ml MRSB steril untuk diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam. Kultur yang telah diinkubasi siap untuk digunakan.
Pengawetan kultur perlu dilakukan untuk menjaga kualitas kultur. Pada penelitian ini pengawetan dilakukan dengan metode penjeratan imobilisasi pada manik-manik. Suspensi
bakteri asam laktat yang sudah ditumbuhkan selama 24 jam dalam medium MRSB dimasukkan ke dalam tabung yang berisi gliserol steril perbandingan kultur dan gliserol 4:1, kemudian
dikocok merata. Setelah itu, campuran suspensi bakteri dan gliserol tersebut dimasukkan ke
14 dalam tabung yang berisi manik-manik, sampai manik-manik terendam. Campuran dikocok
dan didiamkan selama 2-3 jam. Sisa cairan dipipet dan dibuang. Kultur yang telah terimobilisasi disimpan pada suhu -20°C.
Gambar 4. Diagram alir tahapan penelitian
2. Uji Pertumbuhan BAL pada Media yang Mengandung Senyawa Uji
Sebanyak 50 µl kultur bakteri asam laktat dalam MRSB berumur 24 jam dimasukkan ke dalam masing-masing 5 ml media yang mengandung senyawa uji. Media tersebut antara lain :
a. MRSB yang mengandung 2-propanol 4 vv
Tahap 3 Uji ketahanan terhadap pH dan
garam empedu Analisis:
Total BAL pada awal dan akhir inkubasi
Analisis: Konsentrasi
kolesterol terasimilasi Analisis:
Zona presipitasi pada media
BAL isolat ASI yang berpotensi menurunkan kolesterol
Tahap 2
Uji aktivitas bile salt
hydrolase BSH
Uji asimilasi kolesterol
37 Isolat bakteri asam laktat isolat ASI
Uji pertumbuhan pada media MRSB yang mengandung senyawa uji, antara lain:
1. 2-propanol
2. natrium tioglikolat
3. garam empedu oxgall
4. kombinasi 2-propanol, natrium tioglikolat,
dan garam empedu.
BAL Isolat ASI yang mampu tumbuh pada semua media yang mengandung
senyawa uji Tahap 1
Analisis: Pertumbuhan secara
kualitatif
15 b.
MRSB yang mengandung natrium tioglikolat 0.2 bv c.
MRSB yang mengandung oxgall 0.2 dan 0.3 bv d.
MRSB yang mengandung 2-propanol 4 vv, natrium tioglikolat 0.2 bv, dan oxgall 0.3 bv.
Setelah diinokulasi, media a dan b diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C. Media c diinkubasi selama 24 dan 48 jam, sedangkan media d diinkubasi selama 20 dan 48 jam pada
suhu 37°C. Sebagai kontrol, kultur bakteri asam laktat juga diinokulasikan ke dalam media MRSB yang tidak mengandung senyawa uji lalu diinkubasi pada suhu 37°C.
3. Uji Ketahanan terhadap pH Rendah dan Garam Empedu
Kategori