15 b.
MRSB yang mengandung natrium tioglikolat 0.2 bv c.
MRSB yang mengandung oxgall 0.2 dan 0.3 bv d.
MRSB yang mengandung 2-propanol 4 vv, natrium tioglikolat 0.2 bv, dan oxgall 0.3 bv.
Setelah diinokulasi, media a dan b diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C. Media c diinkubasi selama 24 dan 48 jam, sedangkan media d diinkubasi selama 20 dan 48 jam pada
suhu 37°C. Sebagai kontrol, kultur bakteri asam laktat juga diinokulasikan ke dalam media MRSB yang tidak mengandung senyawa uji lalu diinkubasi pada suhu 37°C.
3. Uji Ketahanan terhadap pH Rendah dan Garam Empedu
a. Uji Ketahanan terhadap pH Rendah Ngatirah
et al. 2000
Sebanyak 1 10
6
-10
7
cfuml kultur yang telah disegarkan dalam MRSB selama 24 jam masing-masing diinokulasikan ke dalam MRSB yang terlebih dahulu diatur pH-nya
sampai pH 2 menggunakan HCl 37, kemudian diinkubasi selama 5 jam pada suhu 37ºC. Hal ini disesuaikan dengan lamanya makanan berada di dalam lambung, yaitu 2-6 jam
Gropper et al. 2009. Pada awal dan akhir inkubasi 0 dan 5 jam dilakukan perhitungan jumlah total BAL dengan menggunakan metode hitungan cawan pada media MRSA.
b. Uji Ketahanan Terhadap Garam Empedu Modifikasi Ngatirah
et al. 2000
Pengujian ini dilakukan sesuai dengan prosedur yang dilakukan Ngatirah et al. 2000, namun dalam penelitian ini tidak dilakukan pengukuran optical density OD.
Jumlah bakteri dihitung menggunakan metode hitungan cawan. Sebanyak 1 10
6
-10
7
cfuml kultur yang telah disegarkan dalam MRSB selama 24 jam ditumbuhkan dalam media MRSB yang mengandung 0.5 oxgall, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada
suhu 37ºC. Pada awal dan akhir inkubasi 0 dan 24 jam dilakukan perhitungan jumlah total BAL dengan menggunakan metode hitungan cawan pada media MRSA.
4. Uji Asimilasi Kolesterol secara
in vitro Modifikasi Kimoto et al. 2002
Uji asimilasi kolesterol pada penelitian ini menggunakan metode Kimoto et al. 2002 dengan modifikasi pada jumlah dan pelarut kolesterol yang digunakan. Kimoto et al. 2002
menggunakan etanol sebagai pelarut kolesterol dengan konsentrasi akhir kolesterol dalam broth sebesar 70 µgml. Dalam penelitian ini digunakan 2-propanol untuk melarutkan kolesterol.
MRSB yang mengandung 0.2 natrium tioglikolat bv dan 0.3 oxgall bv ditambah dengan larutan kolesterol steril 2.5 mgml dalam 2-propanol sehingga konsentrasi akhir
kolesterol dalam broth 95 µgml. Sebanyak 10 ml campuran tersebut diinokulasi dengan 100 µl kultur bakteri asam laktat, kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 20 jam. Setelah
diinkubasi, sel dipisahkan dari larutan dengan sentrifugasi selama 10 menit pada 12000 x g dan suhu 4°C. Supernatan yang dihasilkan kemudian diukur kadar kolesterolnya. Diagram alir uji
asimilasi ini dapat dilihat pada Gambar 5.
16 disterilisasi dengan membran filter disterilisasi pada suhu 121°C, 15 menit
diambil 10 ml ke dalam tabung reaksi diinokulasi dengan 100 µl kultur
diinkubasi pada suhu 37°C, 20 jam disentrifugasi pada 12000 x g, suhu 4°C, 10 menit
diukur kadar kolesterolnya Gambar 5. Diagram alir uji asimilasi kolesterol Modifikasi Kimoto et al. 2002
5. Uji Aktivitas
Bile Salt Hydrolase BSH Modifikasi Surono 2003
Uji aktivitas enzim BSH dilakukan dengan metode Surono 2003 dengan modifikasi pada umur dan jumlah kultur yang digunakan, serta cara inokulasi kultur. Surono 2003
melakukan uji aktivitas BSH dengan mencelupkan kertas saring steril berdiameter 8 mm ke dalam kultur berumur 12 jam, kemudian kertas saring tersebut diletakkan di atas MRSA
kontrol dan MRSA yang mengandung 0.5 sodium taurodeoksikolat TDCA dan 0.37 gL CaCl
2
. Setelah itu dilakukan inkubasi secara anaerob pada suhu 37ºC selama 72 jam. Dalam penelitian ini, kultur yang digunakan berumur 18 jam kondisi stasioner. Inokulasi kultur pada
media kontrol dan media uji dilakukan dengan dua cara. Cara pertama, kertas saring steril dibasahi dengan kultur sebanyak 10 µl. Setelah ditiriskan, kertas saring tersebut diletakkan di
atas media kontrol dan media uji. Cara kedua dilakukan dengan meletakkan satu ose kultur pada media kontrol dan media uji.
C. METODE ANALISIS
1. Analisis Pertumbuhan secara Kualitatif
Adanya pertumbuhan BAL pada medium yang mengandung senyawa uji 2-propanol, natrium tioglikolat, oxgall, dan campuran ketiganya diamati berdasarkan kekeruhan
kualitatif yang terjadi pada media. Pengamatan dilakukan secara subjektif dengan membandingkan tingkat kekeruhan media yang mengandung senyawa uji dengan media
kontrol tidak mengandung senyawa uji. MRSB yang mengandung 0.2 Natrium
tioglikolat bv dan 0.3 oxgall bv larutan kolesterol
2.5 mgml dalam 2- propanol
supernatan pelet
