BAB III METODE PENELITIAN
3.1 Desain Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian true experimental karena randomisasi, kontrol, perlakuan, dan replikasi. Adapun rancangannya
adalah post test only control group design.
Keterangan
P : populasi AR : alokasi random
Ko : kelompok hewan coba tanpa cedera kepala K1 : kelompok hewan coba cedera kepala yang tidak diberi Melatonin
K2 : kelompok hewan coba cedera kepala yang diberi Melatonin Po : Perlakuan tidak ada
P1 : Perlakuan cedera kepala tanpa diberi Melatonin P2 : Perlakuan cedera kepala diberi Melatonin
Oo : Observasi kelompok tanpa cedera O1 : Observasi kelompok cedera kepala tanpa Melatonin
O2 : Observasi kelompok cedera kepala diberi Melatonin
P1 K1
O-1 O-
P2 K2
AR P0
K0 O-0
P
Universitas Sumatera Utara
3.2 Populasi dan Sampel 3.2.1 Populasi
Pada penelitian ini menggunakan hewan coba tikus Rattus Novergicus
strain Sprague Dawley dengan kriteria jenis kelamin jantan, umur 10-12 minggu, dan berat badan 200-300 gram.
3.2.2 Sampel
Tikus Rattus Novergicus strain Sprague Dawley berjenis kelamin jantan, berumur 10-12 minggu dan berat antara 200-300 gram.
3.2.3 Perkiraan Besar Sampel
Berdasarkan rumus besar sampel Federer diperoleh hasil Supardi, 2012.
n-1 t- 1 ≥ 15
Keterangan : n
: besar sampel t : jumlah kelompok coba
Besar sampel yang dibutuhkan adalah n-1 3-
1 ≥ 15 n ≥ 9
Jadi, sampel yang dibutuhkan adalah sebanyak 9 hewan coba untuk tiap-tiap kelompok. Jika ditambahkan dengan perkiraan drop out 10,
besar sampel minimal yang diperlukan untuk tiap kelompok adalah 10 hewan coba. Jumlah keseluruhan hewan coba yang dibutuhkan adalah 30
ekor. 60
Universitas Sumatera Utara
3.2.4 Cara Kerja dan Alur Penelitian 1.
Kelompok Penelitian
Tikus Sprague Dawley yang memenuhi kriteria penelitian dilakukan randomisasi menjadi 3 kelompok perlakuan, yakni kelompok kontrol dan
kelompok perlakuan kelompok yang tidak diberi Melatonin dan kelompok yang diberi Melatonin. Kelompok perlakuan diberikan anestesi ketamin,
kemudian dibuat cedera kepala dengan cara tikus yang sudah terbius dibuat kraniotomi dengan insisi koronar. Setelah duramater tampak, tikus
kemudian dijatuhi beban seberat 20 gram dari ketinggian 20 cm pada daerah tersebut Feeney et al., 1981. Kelompok perlakuan mendapat
injeksi Melatonin dengan dosis 2,5 mgkgBB intraperitoneal satu jam setelah proses cedera kepala Kerman et al., 2005. Kemudian, dosis
diulang tiap 12 jam sehingga total dosis 7,5mgkgBB, sedangkan kelompok perlakuan tanpa diberi Melatonin setelah proses cedera kepala
dijahit kulitnya dan tidak diberikan Melatonin.
Gambar 3.1 Skematik alat cedera kepala Marmarou, 1994
Universitas Sumatera Utara
Ketiga kelompok dipelihara dengan cara dan perlakuan yang sama. Setelah pemeliharaan selama tujuh hari ketiga kelompok hewan coba
diberikan injeksi fenobarbital dosis tinggi, kemudian spesimen jaringan otak diperiksa untuk ekspresi MPO, MDA, VEGF, dan AQP4 dengan
metode pewarnaan.
2. Teknik pemrosesan jaringan sumber Perhimpunan Dokter Spesialis
Patologi Indonesia, 2008 : Bahan yang telah diisolasi dari hewan coba segera difiksasi dengan
formalin buffer 10 pH: 7,4 selama 15-24 jam ketebalan jaringan sekitar 0,5 cm. Adapun tujuan fiksasi adalah untuk mempertahankan morfologi
sel seperti semula, mencegah otolisis dan mencegah pertumbuhan bakteri atau jamur. Setelah dilakukan fiksasi, jaringan tersebut dicuci dengan air
mengalir sekitar 20 menit dan kemudian dilakukan dehidrasi dengan menggunakan etanol persentase yang meningkat yaitu dari 70, 80,
masing-masing1 jam, Setelah itu etanol 95 diberikan sebanyak dua kali, yaitu etanol 95 pertama selama 2 jam dan etanol 95 berikutnya
selama 1 jam. Selanjutnya, dimasukkan lagi kedalam etanol absolute 100 masing-masing 1 jam. Setelah dilakukan dehidrasi, dilakukan
penjernihan clearing dengan menggunakan xylol. Tujuan dari penjernihan ini adalah medium mediator yang menghilangkan larutan
dehidran dari jaringan dan juga dapat saling larut dengan bahan embedding
paraffin, sehingga paraffin dapat melakukan infiltrasi didalam jaringan yang diproses. Adapun tahapannya adalah memasukkan jaringan
Universitas Sumatera Utara
ke dalam xylol tiga kali. Pada xylol pertama dan kedua masing-masing dimasukkan selama satu jam, dan pada xylol ketiga selama dua jam.
Setelah dilakukan penjernihan, jaringan tersebut dimasukkan kedalam paraffin, cair 56-58
o
C sebanyak tiga kali, masing-masing dua jam. Tujuannya adalah agar bahan embedding ini selain melarutkan bahan
xylol di dalam jaringan paraffin juga melakukan infiltrasi kedalam jaringan. Akhirnya pada saat embedding jaringan tersebut benar-benar menyatu
dan memiliki konsistensi yang hampir sama, sehingga mudah dilakukan penyayatan dengan microtome. Adapun ketebalan sayatan jaringan
dengan menggunakan microtome ini adalah sekitar 4-6 μ. Jaringan yang
telah disayat kemudian diambil dengan kuas dan diletakkan di permukaan air pada waterbath dengan temperature sekitar 45-55
o
C. Setelah itu, diambil dengan menggunakan object glass yang telah dilapisi dengan poly
L lisin. Selanjutnya, dikeringkan pada plate panas sekitar 58-60
o
C selama satu jam dan kemudian didinginkan pada suhu kamar dan siap
diwarnai.
3. Prosedur Pewarnaan a. Pewarnaan Haematoxylin Eosin HE
sumber Departemen Patologi Anatomi Fak. Kedokteran USU:
Jaringan yang telah disayat dengan microtome diletakkan pada object glass
dan kemudian dilakukan deparaffinisasi, yaitu menarik atau menghilangkan paraffin yang ada di dalam jaringan. Adapun caranya
adalah dengan memasukkan sayatan jaringan tersebut secara berturut-
Universitas Sumatera Utara
turut ke dalam xylol sebanyak tiga kali dua menit. Kemudian, secara berturut-turut dimasukkan ke dalam etanol dengan konsentrasi menurun
bertahap,yaitu mulai dari etanol 100 tiga kali satu menit, kemudian 95 dua kali satu menit, dan 90, 80, dan 70 masing-masing
satu menit. Setelah itu, dilakukan pencucian dengan air kran sekitar lima menit, dan dimasukkan kedalam Haris Haematoxylin enam menit.
Selanjutnya dibilas dengan air dan dimasukkan ke dalam alkohol asam 1 3-5 celup dan dibilas lagi dengan air. Kemudian, dicelupkan pada air
ammoniak sampai berwarna biru, dimasukkan ke dalam larutan eosin, dan berturut-turut dimasukkan ke dalam etanol 95 dua kali satu
menit, xylol tiga kali dua menit. Selanjutnya, dilakukan mounting dan diamati pada mikroskop.
b. Pewarnaan Imunohistokimia sumber Departemen Patologi Anatomi
Fak. Kedokteran USU: Pewarnaan imunohistokimia yang digunakan pada penelitian ini
adalah untuk menentukan MDA dan MPO pada sel mikroglia serta VEGFdan AQP-4 pada SDO
1 Pewarnaan Imunohistokimia Malondialdehyde
Pewarnaan Imunohistokimia Malondialdehyde jaringan yang telah disayat dengan microtome diletakkan pada object glass dan kemudian
dilakukan deparaffinisasi, yaitu menarik atau menghilangkan paraffin yang ada di dalam jaringan. Adapun caranya adalah dengan memasukkan
sayatan jaringan tersebut secara berturut-turut ke dalam xylol sebanyak
Universitas Sumatera Utara
tiga kali dua menit. Setelah itu, dimasukkan secara berturut-turut ke dalam etanol dengan konsentrasi bertahap menurun yaitu mulai dari
etanol 100 tiga kali satu menit, 95 dua kali satu menit, serta 90, 80, dan 70 masing-masing satu menit. Setelah itu, dilakukan
pencucian dengan air kran sekitar 5 menit. Kemudian jaringan dimasukkan pada peroksida 3 30 menit untuk menghilangkan peroksidase
endogenus. Selanjutnya, dicuci dengan air, dibilas dengan aquadestilat dan PBS masing-masing dua menit. Setelah itu, dimasukkan ke dalam
larutan trypsin 0,025 dalam PBS pH.7,4 selama enam menit pada 37
o
C. Kemudian, dicuci dengan PBS tiga kali dua menit, dan dimasukkan ke dalam antibodi primer anti Malondialdehyde mouse anti
Rat selama 30 menit, dicuci dengan PBS 3 kali dua menit,
dimasukkan ke
dalam antibodi
sekunder yaitu
Rabbit anti
imousebiotinilated label selama 30 menit. Selanjutnya dicuci dengan PBS
dua kali dua menit, dan berturut-turut dimasukkan ke dalam streptavidin HRP label selama 30 menit, dicuci dengan PBS tiga kali
dua menit, dimasukkan ke dalam substrat kromogen DAB solution selama lima menit, dicuci dengan PBS tiga kali dua menit, dibilas
dengan aquadestilata, dimasukkan ke dalam Mayer Hematoxylin selama enam menit, dicuci dengan air mengalir, dan akhirnya dilakukan mounting
dan dapat diamati pada mikroskop cahaya.
Universitas Sumatera Utara
2 Pewarnaan Imunohistokimia Myeloperoksidase
Pewarnaan Imunohistokimia Myeloperoksidase dilakukan dengan cara: jaringan yang telah disayat dengan microtome diletakkan pada
object glass dan kemudian dilakukan deparaffinisasi, yaitu menarik atau
menghilangkan paraffin yang ada di dalam jaringan. Ada caranya adalah dengan memasukkan sayatan jaringan tersebut secara berturut-turut ke
dalam xylol sebanyak tiga kali dua menit, dimasukkan secara berturut-turut ke dalam etanol dengan konsentrasi bertahap menurun,
yaitu mulai dari etanol 100 tiga kali satu menit, 95 dua kali satu menit, selanjutnya 90, 80, dan 70 masing-masing satu menit.
Setelah itu, dilakukan pencucian dengan air kran sekitar 5 menit. Kemudian dimasukkan pada peroksida 3 30 menit untuk
menghilangkan peroksidase endogenus. Selanjutnya, jaringan dicuci dengan air, dibilas dengan aquadestilat, dan PBS masing-masing dua
menit. Setelah itu, dimasukkan ke dalam larutan trypsin 0,025 dalam PBS pH.7,4 selama enam menit pada 37
o
C. Kemudian jaringan dicuci dengan PBS tiga kali dua menit, dimasukkan ke dalam antibodi primer
anti myeloperoksidase mouse anti Rat selama 30 menit, dan dicuci dengan PBS 3 kali dua menit, dimasukkan ke dalam antibodi
sekunder yaitu Rabbit anti imousebiotinilated label selama 30 menit. Selanjutnya dicuci dengan PBS dua kali dua menit, secara berturut-
turut dimasukkan ke dalam streptavidin HRP label selama 30 menit, dicuci dengan PBS tiga kali dua menit, dimasukkan ke dalam substrat
Universitas Sumatera Utara
kromogen DAB solution selama lima menit, dicuci dengan PBS tiga kali dua menit, dibilas dengan aquadestilata, dimasukkan ke dalam Mayer
Hematoxylin selama enam menit, dicuci dengan air mengalir, dan akhirnya dilakukan mounting dan dapat diamati pada mikroskop cahaya.
3 Pewarnaan Imunohistokimia VEGF
Pewarnaan Imunohistokimia VEGF dilakukan dengan cara: jaringan yang telah disayat dengan microtome diletakkan pada object glass dan
kemudian dilakukan deparaffinisasi, yaitu menarik atau menghilangkan paraffin yang ada di dalam jaringan. Adapun caranya adalah dengan
memasukkan sayatan jaringan tersebut secara berturut-turut ke dalam xylol sebanyak tiga kali dua menit. Setelah itu, dimasukkan secara
berturut-turut ke dalam etanol dengan konsentrasi bertahap menurun, yaitu mulai dari etanol 100 tiga kali satu menit, 95 dua kali
satu menit, selanjutnya 90, 80, dan 70 masing-masing satu menit, setelah itu dilakukan pencucian dengan air kran sekitar 5 menit dan
dimasukkan pada peroksida 3 30 menit untuk menghilangkan peroksidase endogenus. Kemudian, dilakukan pencucian dengan air,
dibilas dengan aquadestilat, dan PBS masing-masing dua menit. Selanjutnya, dimasukkan ke dalam larutan trypsin 0,025 dalam PBS
pH.7,4 selama enam menit pada 37
o
C. Setelah dicuci dengan PBS tiga kali dua menit, jaringan dimasukkan ke dalam antibodi primer anti
VEGF mouse anti Rat selama 30 menit, dicuci dengan PBS tiga kali dua menit, selanjutnya dimasukkan ke dalam antibodi sekunder yaitu
Universitas Sumatera Utara
Rabbit anti mousebiotinilated label selama 30 menit. Selanjutnya, dicuci
dengan PBS dua kali dua menit, dan berturut-turut dimasukkan ke dalam streptavidin HRP label selama 30 menit, dicuci dengan PBS tiga
kali dua menit, dimasukkan ke dalam substrat kromogen DAB solution
selama lima menit, dicuci dengan PBS tiga kali dua menit, dibilas dengan aquadestilata, dimasukkan ke dalam Mayer Hematoxylin
selama enam menit, dicuci dengan air mengalir, dan akhirnya dilakukan mounting
dan dapat diamati pada mikroskop cahaya.
4 Pewarnaan Imunohistokimia AQP-4
Pewarnaan Imunohistokimia AQP-4 dilakukan dengan cara: jaringan yang telah disayat dengan microtome diletakkan pada object glass dan
dilakukan deparaffinisasi, yaitu menarik atau menghilangkan paraffin yang ada di dalam jaringan. Adapun caranya adalah dengan memasukkan
sayatan jaringan tersebut secara berturut-turut ke dalam xylol sebanyak tiga kali dua menit, dimasukkan secara berturut-turut ke dalam etanol
dengan konsentrasi bertahap menurun, yaitu mulai dari etanol 100 tiga kali satu menit, 95 dua kali satu menit, serta 90, 80, dan
70 masing-masing satu menit dan kemudian dilakukan pencucian dengan air kran sekitar 5 menit. Setelah itu, jaringan dimasukkan pada
peroksida 3 30 menit untuk menghilangkan peroksidase endogenus. Kemudian, dilakukan pencucian dengan air, dibilas dengan aquadestilat,
dan PBS masing-masing dua menit. Selanjutnya, dimasukkan ke dalam larutan trypsin 0,025 dalam PBS pH.7,4 selama enam menit pada
Universitas Sumatera Utara
37
o
C, dicuci dengan PBS tiga kali dua menit, dimasukkan ke dalam primer antibodi anti AQP-4 mouse anti Rat selama 30 menit, dicuci
dengan PBS tiga kali dua menit. Selanjutnya, dimasukkan ke dalam antibodi sekunder yaitu Rabbit antimousebiotinilated label selama 30
menit. Selanjutnya dicuci dengan PBS dua kali dua menit, dan secara berturut-turut dimasukkan ke dalam streptavidin HRP label selama 30
menit, dicuci dengan PBS tiga kali dua menit, dimasukkan ke dalam substrat kromogen DAB solution selama lima menit, dicuci dengan PBS
tiga kali dua menit, dibilas dengan aquadestilata, dimasukkan ke dalam Mayer Hematoxylin selama enam menit, dicuci dengan air mengalir,
dan akhirnya dilakukan mounting dan dapat diamati pada mikroskop cahaya.
Universitas Sumatera Utara
3.2.5 Kerangka Operasional
3.2.6 Identifikasi Variabel Variabel Bebas
Variabel bebas dalam penelitian ini adalah Kondisi edema serebri pada hewan coba, hasil penelitian pendahuluan atau penelitian oleh
peneliti terdahulu. AKLIMASI
HEWAN COBA RANDOMISASI
ANALISIS STATISTIK
EVALUASI: 1. MDA
2. MPO 3. VEGF
4. AQP-4 KELOMPOK-2
CEDERA KEPALA
DIBERI MELATONIN
KELOMPOK-0
TIDAK CEDERA KEPALA
Normal
EVALUASI: 1. MDA
2. MPO 3. VEGF
4. AQP-4 KELOMPOK-1
CEDERA KEPALA
KONTROL -
EVALUASI: 1. MDA
2. MPO 3. VEGF
4. AQP-4
Universitas Sumatera Utara
Variabel Kendali
Variabel kendali dalam penelitian ini adalah jenis hewan coba, jenis kelamin, umur, berat badan, model cedera otak, macam obat perlakuan,
dosis obat perlakuan, teknik pengambilan dan pemeriksaan sampel.
Variabel Tergantung
Hasil ekspresi MDA, MPO,VEGF dan AQP-4. 3.2.7 Definisi Operasional Penelitian
Cedera kepala adalah jejas atau perlukaan jaringan otak bukan karena proses degeneratif atau bawaan lahir, melainkan akibat dorongan
dari luar yang dapat mengakibatkan penurunan ataupun perubahan status kesadaran.
Malondialdehyde adalah molekul oksigen tunggal dan diproduksi
berkesinambungan pada
keadaan aerobik,
diukur dengan
Immunohistokimia, yang diamati sebanyak 10 kali lapang pandang, dengan pembesaran 400x, diukur dalam satuan pgdl dinyatakan dalam
skala ratio. Myeloperoxidase
adalah enzim pada jaringan otak memberikan reaksi positif terhadap antimyeloperoxidase, dengan pewarnaan
Immunohistokimia, yang diamati sebanyak 10 kali lapang pandang, dengan pembesaran 400x, diukur dalam satuan pgdl dinyatakan dalam
skala ratio. Vascular Enddothelial Growth Factor
adalah jumlah endotel pada jaringan otak yang memberikan reaksi positif terhadap anti VEGF, diukur
Universitas Sumatera Utara
dengan cara Immunohistokimia, yang diamati sebanyak 10 kali lapang pandang, dengan pembesaran 400x, dinyatakan dalam skala ordinal
berupa skor intensitas warna coklat berupa 0 negatif, +1 lemah, +2 sedang dan +3 kuat. Skor 0 negatif dan =1 lemah pada penelitian ini
menjadi – negatif, skor +2 sedang dan +3 kuat menjadi nilai + positif.
Aquaporin-4 adalah kadar protein membran integral kecil dengan
berat molekul kurang dari 30.000 kDa memiliki permeabilitas tinggi, berperan dalam transportasi cairan di membran plasma sel, dan
ditemukan terutama di ventrikel serebral dan ruang subarachnoid, cara ukur dengan Immunohistokimia, yang diamati sebanyak 10 kali lapang
pandang, dengan pembesaran 400x, dinyatakan dalam skala ordinal berupa skor intensitas warna coklat berupa 0 negatif, +1 lemah, +2
sedang dan +3 kuat. Skor 0 negatif dan =1 lemah pada penelitian ini menjadi
– negatif, skor +2 sedang dan +3 kuat menjadi nilai + positif. Melatonin adalah bahan yang diperoleh dari Sigma Life science
Product of China M5250- β50 MG powder,≥ 98 TLC Lot SLBC 75γ9 V
P Code : 1001352563 CAS : 73-31-4 C13H16N2O2 MW 232-28, form : powder store at : -20ºC, Solubility : H2O : Soluble 0,1 mgml, color : of
white, Exp date 2015-05, Address SIGMA-ALDRICH, CO.,3090 Spruce Street, St. Louis. MO 63103 USA 314-771-5765.
3.3 Etika Penelitian
Penelitian ini diajukan untuk mendapat izin dari Komite Etika Penelitian Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara.
Universitas Sumatera Utara
3.4 Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di bagian Animal Laboratorium Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya dari bulan Mei sampai dengan
November tahun 2014.
Universitas Sumatera Utara
BAB IV HASIL DAN ANALISIS
Bab ini akan mengulas hasil percobaan yang telah dilakukan dan memaparkan interpretasi hasil beserta analisisnya, dalam kaitannya
dengan kerangka konsep dan hipotesis penelitian.
4.1 Karakteristik Subjek Penelitian
Penelitian ini mengkaji peran Melatonin dalam menghambat enzim myeloperoxidase.
Dengan menggunakan model cedera kepala pada hewan tikus Rattus norvegicus, penelitian ini diharapkan dapat
menjelaskan manfaat Melatonin kaitannya dengan proses edema serebri. Karakteristik hewan model yang digunakan, seperti berat badan,
tertera dalam table berikut.
Tabel 4.1 Hasil dan Analisa Data Berat Badan Tikus
Berat badan tikus gram p-value
rerata 290,07
0,155 SD
+ 10,48
Keterangan: Uji Homogenenitas berat badan tikus Rattus norvegicus sebagai model pascacedera kepala
Dengan uji levene test, tampak bahwa p0.05, sehingga bisa dinyatakan berat badan model tidak berbeda secara signifikan. Uji
homogenitas terhadap berat badan tikus, menunjukkan bahwa tidak terdapat perbedaan yang bermakna pada berat badan masing-masing
hewan model.
Universitas Sumatera Utara