Desain Penelitian Etika Penelitian Lokasi dan Waktu Penelitian

BAB III METODE PENELITIAN

3.1 Desain Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian true experimental karena randomisasi, kontrol, perlakuan, dan replikasi. Adapun rancangannya adalah post test only control group design. Keterangan P : populasi AR : alokasi random Ko : kelompok hewan coba tanpa cedera kepala K1 : kelompok hewan coba cedera kepala yang tidak diberi Melatonin K2 : kelompok hewan coba cedera kepala yang diberi Melatonin Po : Perlakuan tidak ada P1 : Perlakuan cedera kepala tanpa diberi Melatonin P2 : Perlakuan cedera kepala diberi Melatonin Oo : Observasi kelompok tanpa cedera O1 : Observasi kelompok cedera kepala tanpa Melatonin O2 : Observasi kelompok cedera kepala diberi Melatonin P1 K1 O-1 O- P2 K2 AR P0 K0 O-0 P Universitas Sumatera Utara 3.2 Populasi dan Sampel 3.2.1 Populasi Pada penelitian ini menggunakan hewan coba tikus Rattus Novergicus strain Sprague Dawley dengan kriteria jenis kelamin jantan, umur 10-12 minggu, dan berat badan 200-300 gram.

3.2.2 Sampel

Tikus Rattus Novergicus strain Sprague Dawley berjenis kelamin jantan, berumur 10-12 minggu dan berat antara 200-300 gram.

3.2.3 Perkiraan Besar Sampel

Berdasarkan rumus besar sampel Federer diperoleh hasil Supardi, 2012. n-1 t- 1 ≥ 15 Keterangan : n : besar sampel t : jumlah kelompok coba Besar sampel yang dibutuhkan adalah n-1 3- 1 ≥ 15 n ≥ 9 Jadi, sampel yang dibutuhkan adalah sebanyak 9 hewan coba untuk tiap-tiap kelompok. Jika ditambahkan dengan perkiraan drop out 10, besar sampel minimal yang diperlukan untuk tiap kelompok adalah 10 hewan coba. Jumlah keseluruhan hewan coba yang dibutuhkan adalah 30 ekor. 60 Universitas Sumatera Utara

3.2.4 Cara Kerja dan Alur Penelitian 1.

Kelompok Penelitian Tikus Sprague Dawley yang memenuhi kriteria penelitian dilakukan randomisasi menjadi 3 kelompok perlakuan, yakni kelompok kontrol dan kelompok perlakuan kelompok yang tidak diberi Melatonin dan kelompok yang diberi Melatonin. Kelompok perlakuan diberikan anestesi ketamin, kemudian dibuat cedera kepala dengan cara tikus yang sudah terbius dibuat kraniotomi dengan insisi koronar. Setelah duramater tampak, tikus kemudian dijatuhi beban seberat 20 gram dari ketinggian 20 cm pada daerah tersebut Feeney et al., 1981. Kelompok perlakuan mendapat injeksi Melatonin dengan dosis 2,5 mgkgBB intraperitoneal satu jam setelah proses cedera kepala Kerman et al., 2005. Kemudian, dosis diulang tiap 12 jam sehingga total dosis 7,5mgkgBB, sedangkan kelompok perlakuan tanpa diberi Melatonin setelah proses cedera kepala dijahit kulitnya dan tidak diberikan Melatonin. Gambar 3.1 Skematik alat cedera kepala Marmarou, 1994 Universitas Sumatera Utara Ketiga kelompok dipelihara dengan cara dan perlakuan yang sama. Setelah pemeliharaan selama tujuh hari ketiga kelompok hewan coba diberikan injeksi fenobarbital dosis tinggi, kemudian spesimen jaringan otak diperiksa untuk ekspresi MPO, MDA, VEGF, dan AQP4 dengan metode pewarnaan.

2. Teknik pemrosesan jaringan sumber Perhimpunan Dokter Spesialis

Patologi Indonesia, 2008 : Bahan yang telah diisolasi dari hewan coba segera difiksasi dengan formalin buffer 10 pH: 7,4 selama 15-24 jam ketebalan jaringan sekitar 0,5 cm. Adapun tujuan fiksasi adalah untuk mempertahankan morfologi sel seperti semula, mencegah otolisis dan mencegah pertumbuhan bakteri atau jamur. Setelah dilakukan fiksasi, jaringan tersebut dicuci dengan air mengalir sekitar 20 menit dan kemudian dilakukan dehidrasi dengan menggunakan etanol persentase yang meningkat yaitu dari 70, 80, masing-masing1 jam, Setelah itu etanol 95 diberikan sebanyak dua kali, yaitu etanol 95 pertama selama 2 jam dan etanol 95 berikutnya selama 1 jam. Selanjutnya, dimasukkan lagi kedalam etanol absolute 100 masing-masing 1 jam. Setelah dilakukan dehidrasi, dilakukan penjernihan clearing dengan menggunakan xylol. Tujuan dari penjernihan ini adalah medium mediator yang menghilangkan larutan dehidran dari jaringan dan juga dapat saling larut dengan bahan embedding paraffin, sehingga paraffin dapat melakukan infiltrasi didalam jaringan yang diproses. Adapun tahapannya adalah memasukkan jaringan Universitas Sumatera Utara ke dalam xylol tiga kali. Pada xylol pertama dan kedua masing-masing dimasukkan selama satu jam, dan pada xylol ketiga selama dua jam. Setelah dilakukan penjernihan, jaringan tersebut dimasukkan kedalam paraffin, cair 56-58 o C sebanyak tiga kali, masing-masing dua jam. Tujuannya adalah agar bahan embedding ini selain melarutkan bahan xylol di dalam jaringan paraffin juga melakukan infiltrasi kedalam jaringan. Akhirnya pada saat embedding jaringan tersebut benar-benar menyatu dan memiliki konsistensi yang hampir sama, sehingga mudah dilakukan penyayatan dengan microtome. Adapun ketebalan sayatan jaringan dengan menggunakan microtome ini adalah sekitar 4-6 μ. Jaringan yang telah disayat kemudian diambil dengan kuas dan diletakkan di permukaan air pada waterbath dengan temperature sekitar 45-55 o C. Setelah itu, diambil dengan menggunakan object glass yang telah dilapisi dengan poly L lisin. Selanjutnya, dikeringkan pada plate panas sekitar 58-60 o C selama satu jam dan kemudian didinginkan pada suhu kamar dan siap diwarnai.

3. Prosedur Pewarnaan a. Pewarnaan Haematoxylin Eosin HE

sumber Departemen Patologi Anatomi Fak. Kedokteran USU: Jaringan yang telah disayat dengan microtome diletakkan pada object glass dan kemudian dilakukan deparaffinisasi, yaitu menarik atau menghilangkan paraffin yang ada di dalam jaringan. Adapun caranya adalah dengan memasukkan sayatan jaringan tersebut secara berturut- Universitas Sumatera Utara turut ke dalam xylol sebanyak tiga kali dua menit. Kemudian, secara berturut-turut dimasukkan ke dalam etanol dengan konsentrasi menurun bertahap,yaitu mulai dari etanol 100 tiga kali satu menit, kemudian 95 dua kali satu menit, dan 90, 80, dan 70 masing-masing satu menit. Setelah itu, dilakukan pencucian dengan air kran sekitar lima menit, dan dimasukkan kedalam Haris Haematoxylin enam menit. Selanjutnya dibilas dengan air dan dimasukkan ke dalam alkohol asam 1 3-5 celup dan dibilas lagi dengan air. Kemudian, dicelupkan pada air ammoniak sampai berwarna biru, dimasukkan ke dalam larutan eosin, dan berturut-turut dimasukkan ke dalam etanol 95 dua kali satu menit, xylol tiga kali dua menit. Selanjutnya, dilakukan mounting dan diamati pada mikroskop.

b. Pewarnaan Imunohistokimia sumber Departemen Patologi Anatomi

Fak. Kedokteran USU: Pewarnaan imunohistokimia yang digunakan pada penelitian ini adalah untuk menentukan MDA dan MPO pada sel mikroglia serta VEGFdan AQP-4 pada SDO 1 Pewarnaan Imunohistokimia Malondialdehyde Pewarnaan Imunohistokimia Malondialdehyde jaringan yang telah disayat dengan microtome diletakkan pada object glass dan kemudian dilakukan deparaffinisasi, yaitu menarik atau menghilangkan paraffin yang ada di dalam jaringan. Adapun caranya adalah dengan memasukkan sayatan jaringan tersebut secara berturut-turut ke dalam xylol sebanyak Universitas Sumatera Utara tiga kali dua menit. Setelah itu, dimasukkan secara berturut-turut ke dalam etanol dengan konsentrasi bertahap menurun yaitu mulai dari etanol 100 tiga kali satu menit, 95 dua kali satu menit, serta 90, 80, dan 70 masing-masing satu menit. Setelah itu, dilakukan pencucian dengan air kran sekitar 5 menit. Kemudian jaringan dimasukkan pada peroksida 3 30 menit untuk menghilangkan peroksidase endogenus. Selanjutnya, dicuci dengan air, dibilas dengan aquadestilat dan PBS masing-masing dua menit. Setelah itu, dimasukkan ke dalam larutan trypsin 0,025 dalam PBS pH.7,4 selama enam menit pada 37 o C. Kemudian, dicuci dengan PBS tiga kali dua menit, dan dimasukkan ke dalam antibodi primer anti Malondialdehyde mouse anti Rat selama 30 menit, dicuci dengan PBS 3 kali dua menit, dimasukkan ke dalam antibodi sekunder yaitu Rabbit anti imousebiotinilated label selama 30 menit. Selanjutnya dicuci dengan PBS dua kali dua menit, dan berturut-turut dimasukkan ke dalam streptavidin HRP label selama 30 menit, dicuci dengan PBS tiga kali dua menit, dimasukkan ke dalam substrat kromogen DAB solution selama lima menit, dicuci dengan PBS tiga kali dua menit, dibilas dengan aquadestilata, dimasukkan ke dalam Mayer Hematoxylin selama enam menit, dicuci dengan air mengalir, dan akhirnya dilakukan mounting dan dapat diamati pada mikroskop cahaya. Universitas Sumatera Utara 2 Pewarnaan Imunohistokimia Myeloperoksidase Pewarnaan Imunohistokimia Myeloperoksidase dilakukan dengan cara: jaringan yang telah disayat dengan microtome diletakkan pada object glass dan kemudian dilakukan deparaffinisasi, yaitu menarik atau menghilangkan paraffin yang ada di dalam jaringan. Ada caranya adalah dengan memasukkan sayatan jaringan tersebut secara berturut-turut ke dalam xylol sebanyak tiga kali dua menit, dimasukkan secara berturut-turut ke dalam etanol dengan konsentrasi bertahap menurun, yaitu mulai dari etanol 100 tiga kali satu menit, 95 dua kali satu menit, selanjutnya 90, 80, dan 70 masing-masing satu menit. Setelah itu, dilakukan pencucian dengan air kran sekitar 5 menit. Kemudian dimasukkan pada peroksida 3 30 menit untuk menghilangkan peroksidase endogenus. Selanjutnya, jaringan dicuci dengan air, dibilas dengan aquadestilat, dan PBS masing-masing dua menit. Setelah itu, dimasukkan ke dalam larutan trypsin 0,025 dalam PBS pH.7,4 selama enam menit pada 37 o C. Kemudian jaringan dicuci dengan PBS tiga kali dua menit, dimasukkan ke dalam antibodi primer anti myeloperoksidase mouse anti Rat selama 30 menit, dan dicuci dengan PBS 3 kali dua menit, dimasukkan ke dalam antibodi sekunder yaitu Rabbit anti imousebiotinilated label selama 30 menit. Selanjutnya dicuci dengan PBS dua kali dua menit, secara berturut- turut dimasukkan ke dalam streptavidin HRP label selama 30 menit, dicuci dengan PBS tiga kali dua menit, dimasukkan ke dalam substrat Universitas Sumatera Utara kromogen DAB solution selama lima menit, dicuci dengan PBS tiga kali dua menit, dibilas dengan aquadestilata, dimasukkan ke dalam Mayer Hematoxylin selama enam menit, dicuci dengan air mengalir, dan akhirnya dilakukan mounting dan dapat diamati pada mikroskop cahaya. 3 Pewarnaan Imunohistokimia VEGF Pewarnaan Imunohistokimia VEGF dilakukan dengan cara: jaringan yang telah disayat dengan microtome diletakkan pada object glass dan kemudian dilakukan deparaffinisasi, yaitu menarik atau menghilangkan paraffin yang ada di dalam jaringan. Adapun caranya adalah dengan memasukkan sayatan jaringan tersebut secara berturut-turut ke dalam xylol sebanyak tiga kali dua menit. Setelah itu, dimasukkan secara berturut-turut ke dalam etanol dengan konsentrasi bertahap menurun, yaitu mulai dari etanol 100 tiga kali satu menit, 95 dua kali satu menit, selanjutnya 90, 80, dan 70 masing-masing satu menit, setelah itu dilakukan pencucian dengan air kran sekitar 5 menit dan dimasukkan pada peroksida 3 30 menit untuk menghilangkan peroksidase endogenus. Kemudian, dilakukan pencucian dengan air, dibilas dengan aquadestilat, dan PBS masing-masing dua menit. Selanjutnya, dimasukkan ke dalam larutan trypsin 0,025 dalam PBS pH.7,4 selama enam menit pada 37 o C. Setelah dicuci dengan PBS tiga kali dua menit, jaringan dimasukkan ke dalam antibodi primer anti VEGF mouse anti Rat selama 30 menit, dicuci dengan PBS tiga kali dua menit, selanjutnya dimasukkan ke dalam antibodi sekunder yaitu Universitas Sumatera Utara Rabbit anti mousebiotinilated label selama 30 menit. Selanjutnya, dicuci dengan PBS dua kali dua menit, dan berturut-turut dimasukkan ke dalam streptavidin HRP label selama 30 menit, dicuci dengan PBS tiga kali dua menit, dimasukkan ke dalam substrat kromogen DAB solution selama lima menit, dicuci dengan PBS tiga kali dua menit, dibilas dengan aquadestilata, dimasukkan ke dalam Mayer Hematoxylin selama enam menit, dicuci dengan air mengalir, dan akhirnya dilakukan mounting dan dapat diamati pada mikroskop cahaya. 4 Pewarnaan Imunohistokimia AQP-4 Pewarnaan Imunohistokimia AQP-4 dilakukan dengan cara: jaringan yang telah disayat dengan microtome diletakkan pada object glass dan dilakukan deparaffinisasi, yaitu menarik atau menghilangkan paraffin yang ada di dalam jaringan. Adapun caranya adalah dengan memasukkan sayatan jaringan tersebut secara berturut-turut ke dalam xylol sebanyak tiga kali dua menit, dimasukkan secara berturut-turut ke dalam etanol dengan konsentrasi bertahap menurun, yaitu mulai dari etanol 100 tiga kali satu menit, 95 dua kali satu menit, serta 90, 80, dan 70 masing-masing satu menit dan kemudian dilakukan pencucian dengan air kran sekitar 5 menit. Setelah itu, jaringan dimasukkan pada peroksida 3 30 menit untuk menghilangkan peroksidase endogenus. Kemudian, dilakukan pencucian dengan air, dibilas dengan aquadestilat, dan PBS masing-masing dua menit. Selanjutnya, dimasukkan ke dalam larutan trypsin 0,025 dalam PBS pH.7,4 selama enam menit pada Universitas Sumatera Utara 37 o C, dicuci dengan PBS tiga kali dua menit, dimasukkan ke dalam primer antibodi anti AQP-4 mouse anti Rat selama 30 menit, dicuci dengan PBS tiga kali dua menit. Selanjutnya, dimasukkan ke dalam antibodi sekunder yaitu Rabbit antimousebiotinilated label selama 30 menit. Selanjutnya dicuci dengan PBS dua kali dua menit, dan secara berturut-turut dimasukkan ke dalam streptavidin HRP label selama 30 menit, dicuci dengan PBS tiga kali dua menit, dimasukkan ke dalam substrat kromogen DAB solution selama lima menit, dicuci dengan PBS tiga kali dua menit, dibilas dengan aquadestilata, dimasukkan ke dalam Mayer Hematoxylin selama enam menit, dicuci dengan air mengalir, dan akhirnya dilakukan mounting dan dapat diamati pada mikroskop cahaya. Universitas Sumatera Utara

3.2.5 Kerangka Operasional

3.2.6 Identifikasi Variabel Variabel Bebas

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah Kondisi edema serebri pada hewan coba, hasil penelitian pendahuluan atau penelitian oleh peneliti terdahulu. AKLIMASI HEWAN COBA RANDOMISASI ANALISIS STATISTIK EVALUASI: 1. MDA 2. MPO 3. VEGF 4. AQP-4 KELOMPOK-2 CEDERA KEPALA DIBERI MELATONIN KELOMPOK-0 TIDAK CEDERA KEPALA Normal EVALUASI: 1. MDA 2. MPO 3. VEGF 4. AQP-4 KELOMPOK-1 CEDERA KEPALA KONTROL - EVALUASI: 1. MDA 2. MPO 3. VEGF 4. AQP-4 Universitas Sumatera Utara Variabel Kendali Variabel kendali dalam penelitian ini adalah jenis hewan coba, jenis kelamin, umur, berat badan, model cedera otak, macam obat perlakuan, dosis obat perlakuan, teknik pengambilan dan pemeriksaan sampel. Variabel Tergantung Hasil ekspresi MDA, MPO,VEGF dan AQP-4. 3.2.7 Definisi Operasional Penelitian Cedera kepala adalah jejas atau perlukaan jaringan otak bukan karena proses degeneratif atau bawaan lahir, melainkan akibat dorongan dari luar yang dapat mengakibatkan penurunan ataupun perubahan status kesadaran. Malondialdehyde adalah molekul oksigen tunggal dan diproduksi berkesinambungan pada keadaan aerobik, diukur dengan Immunohistokimia, yang diamati sebanyak 10 kali lapang pandang, dengan pembesaran 400x, diukur dalam satuan pgdl dinyatakan dalam skala ratio. Myeloperoxidase adalah enzim pada jaringan otak memberikan reaksi positif terhadap antimyeloperoxidase, dengan pewarnaan Immunohistokimia, yang diamati sebanyak 10 kali lapang pandang, dengan pembesaran 400x, diukur dalam satuan pgdl dinyatakan dalam skala ratio. Vascular Enddothelial Growth Factor adalah jumlah endotel pada jaringan otak yang memberikan reaksi positif terhadap anti VEGF, diukur Universitas Sumatera Utara dengan cara Immunohistokimia, yang diamati sebanyak 10 kali lapang pandang, dengan pembesaran 400x, dinyatakan dalam skala ordinal berupa skor intensitas warna coklat berupa 0 negatif, +1 lemah, +2 sedang dan +3 kuat. Skor 0 negatif dan =1 lemah pada penelitian ini menjadi – negatif, skor +2 sedang dan +3 kuat menjadi nilai + positif. Aquaporin-4 adalah kadar protein membran integral kecil dengan berat molekul kurang dari 30.000 kDa memiliki permeabilitas tinggi, berperan dalam transportasi cairan di membran plasma sel, dan ditemukan terutama di ventrikel serebral dan ruang subarachnoid, cara ukur dengan Immunohistokimia, yang diamati sebanyak 10 kali lapang pandang, dengan pembesaran 400x, dinyatakan dalam skala ordinal berupa skor intensitas warna coklat berupa 0 negatif, +1 lemah, +2 sedang dan +3 kuat. Skor 0 negatif dan =1 lemah pada penelitian ini menjadi – negatif, skor +2 sedang dan +3 kuat menjadi nilai + positif. Melatonin adalah bahan yang diperoleh dari Sigma Life science Product of China M5250- β50 MG powder,≥ 98 TLC Lot SLBC 75γ9 V P Code : 1001352563 CAS : 73-31-4 C13H16N2O2 MW 232-28, form : powder store at : -20ºC, Solubility : H2O : Soluble 0,1 mgml, color : of white, Exp date 2015-05, Address SIGMA-ALDRICH, CO.,3090 Spruce Street, St. Louis. MO 63103 USA 314-771-5765.

3.3 Etika Penelitian

Penelitian ini diajukan untuk mendapat izin dari Komite Etika Penelitian Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara. Universitas Sumatera Utara

3.4 Lokasi dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan di bagian Animal Laboratorium Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya dari bulan Mei sampai dengan November tahun 2014. Universitas Sumatera Utara

BAB IV HASIL DAN ANALISIS

Bab ini akan mengulas hasil percobaan yang telah dilakukan dan memaparkan interpretasi hasil beserta analisisnya, dalam kaitannya dengan kerangka konsep dan hipotesis penelitian.

4.1 Karakteristik Subjek Penelitian

Penelitian ini mengkaji peran Melatonin dalam menghambat enzim myeloperoxidase. Dengan menggunakan model cedera kepala pada hewan tikus Rattus norvegicus, penelitian ini diharapkan dapat menjelaskan manfaat Melatonin kaitannya dengan proses edema serebri. Karakteristik hewan model yang digunakan, seperti berat badan, tertera dalam table berikut. Tabel 4.1 Hasil dan Analisa Data Berat Badan Tikus Berat badan tikus gram p-value rerata 290,07 0,155 SD + 10,48 Keterangan: Uji Homogenenitas berat badan tikus Rattus norvegicus sebagai model pascacedera kepala Dengan uji levene test, tampak bahwa p0.05, sehingga bisa dinyatakan berat badan model tidak berbeda secara signifikan. Uji homogenitas terhadap berat badan tikus, menunjukkan bahwa tidak terdapat perbedaan yang bermakna pada berat badan masing-masing hewan model. Universitas Sumatera Utara