39
BAB III METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian pengaruh pemberian infusa daun sirsak Annona muricata L. secara subkronis terhadap kadar glukosa darah tikus jantan dan betina termasuk
penelitian eksperimental murni dengan menggunakan rancangan penelitian acak lengkap pola searah.
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 1. Variabel penelitian
Varibel-variabel yang terdapat dalam penelitian ini adalah : a. Variabel bebas :
Peringkat dosis infusa daun sirsak. Dosis infusa daun sirsak adalah volume tertentu ml infusa daun sirsak tiap satuan kilogram berat badan subjek
uji yang bersangkutan. b. Variabel tergantung
Kadar glukosa darah tikus jantan dan betina ditandai dengan tolok ukur kuantitatif berupa efek yang ditimbulkan setelah pemberian infusa daun sirsak.
c. Variabel pengacau terkendali 1 Subjek uji berupa tikus :
a Galur Sprague Dawley. b Jantan dan betina.
c Umur 2 – 3 bulan. d Berat badan 170 – 280 g.
e Keadaan fisik berstatus sehat. 2 Bahan uji berupa daun sirsak
a Daun sirsak diambil dari bagian tengah antara pucuk dan pangkal daun, berwarna hijau, utuh, dan segar.
b Diperoleh dari wilayah Jetis, Ngaglik, Sleman, Yogyakarta pada bulan Mei sampai Juni 2012.
d. Variabel pengacau tak terkendali Keadaan patologi tikus jantan dan betina galur Sprague Dawley yang
digunakan; meskipun keadaan fisik sehat, belum menjamin bahwa kadar glukosa darah tikus normal.
2. Definisi Operasional
a. Infusa daun sirsak Infusa serbuk kering daun sirsak dibuat dengan cara menginfundasi
sejumlah 6,0 g serbuk kering daun sirsak dalam air 100,0 ml pada suhu 90
o
C selama 15 menit.
b. Pengaruh pemberian infusa daun sirsak Didefinisikan sebagai efek yang ditimbulkan oleh infusa daun sirsak
terhadap kadar glukosa dalam darah tikus jantan dan betina.
C. Alat dan Bahan Penelitian 1. Alat penelitian
a. Alat-alat pembuatan serbuk kering daun sirsak antara lain : mesin penyerbuk blender, timbangan, oven.
b. Alat-alat penetapan kadar air serbuk daun sirsak antara lain : labu beralas bulat 500 ml, pendingin air balik, alat penampung, tabung penerima 5 ml,
pemanas, tabung penyambung. c. Alat-alat pembuatan infusa daun sirsak antara lain : Bekker glass,
timbangan, batang pengaduk, gelas ukur, panci infusa, heater, Stopwatch, kain flanel.
d. Alat-alat uji toksisitas antara lain : kandang tikus metabolic cage, timbangan, Bekker glass, jarum suntik per oral, spuit injeksi, Eppendorf,
pipa kapiler haematokrit.
2. Bahan penelitian Bahan uji yang digunakan dalam peneletian ini sebagai berikut :
a. Hewan uji yang digunakan yaitu tikus jantan dan betina galur Sprague Dawley
berumur 2 – 3 bulan dengan berat badan 170 – 280 g yang diperoleh dari Laboratorium Hayati Imono, Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma, Yogyakarta. b. Daun sirsak yang digunakan diambil pada bagian tengah antara pucuk dan
pangkal daun dalam kondisi segar berwarna hijau dan utuh. Daun diperoleh dari wilayah Jetis, Ngaglik, Sleman, Provinsi Daerah Istimewa Yogyakarta
pada bulan Mei sampai Juni 2012. c. Pelarut untuk pembuatan sediaan uji yaitu aquadest yang diperoleh dari
Laboratorium Farmakologi-Toksikologi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
d. Asupan pakan hewan uji yaitu pelet AD-2 yang diperoleh dari Laboratorium Hayati Imono, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
e. Asupan minum hewan uji berupa air reverse-osmosis yang diperoleh dari Laboratorium Hayati Imono, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma,
Yogyakarta. f. Pereaksi toluen P diperoleh dari Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia
Universitas Sanata Dharma Yogyakarta
D. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi daun sirsak
Determinasi daun sirsak telah dilakukan dengan cara mencocokkan ciri- ciri yang dipunyai daun sirsak dengan buku acuan Steenis, 1975 hingga
ketingkat spesies. Determinasi disahkan oleh Bapak Yohanes Dwiatmaka, Dosen Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
2. Pengumpulan bahan uji
Bahan uji yang digunakan adalah daun sirsak. Daun yang dipilih adalah daun dalam kondisi segar dan berwarna hijau pada bagian tengah antara pucuk
dan pangkal daun. Daun yang diperoleh hanya berasal dari wilayah Jetis, Ngaglik, Sleman, Provinsi Daerah Istimewa Yogyakarta pada bulan Mei sampai Juni 2012.
3. Pembuatan serbuk kering daun sirsak
Daun sirsak
yang telah
dipetik, dicuci,
dikeringkan, kemudian
dimasukkan ke dalam oven dengan suhu ± 50
o
C selama 72 jam. Daun yang telah kering kemudian diserbuk dan diayak dengan menggunakan ayakan no. 40, dan
dilakukan perhitungan rendemen serbuk daun sirsak.
Rendemen serbuk daun sirsak dihitung dengan menggunakan rumus :
ୠ୭ୠ୭୲ ୢୟ୳୬ ୩ୣ୰୧୬ ୠ୭ୠ୭୲ ୢୟ୳୬ ୠୟୱୟ୦
x 100 Widyastuti and Istini, 2000.
4. Penetapan kadar air serbuk kering daun sirsak
Sebanyak 50 g daun sirsak dimasukkan kedalam 200 ml toluen ke dalam labu beralas bulat. Toleun dituang ke dalam tabung penerima melalui alat
pendingin. Labu beralas bulat dipanaskan selama 15 menit. Setelah toluen mendidih, disuling dengan kecepatan 2 tetes tiap detik hingga sebagian air
tersuling, kecepatan penyulingan dinaikan hingga 4 tetes per detik. Setelah semua air tersuling, bagian dalam pendingin dicuci dengan toluen. Penyulingan
dilanjutkan selama 5 menit. Tabung penerima pendingin dibiarkan hingga suhu kamar. Setelah air dan toluen terpisah sempurna dilakukan pembacaan volume air.
Kadar air dihitung dalam .
5. Penetapan dosis infusa daun sirsak
Peringkat dosis
yang digunakan
berdasarkan pengobatan
pada masyarakat sehari-hari, dosis pada perlakuan ini adalah 2 g 70 kgBB manusia.
Konversi manusia 70 kg ke tikus 200 g = 0,018 Laurence and Bacharach, 1964.
Dosis untuk 200 g tikus = 0,018 x 2 g
= 0,036 g 200gBB tikus Dosis untuk 1 kg tikus
=
ଵ ଶ
x 0,036 = 0,180 g kgBB tikus
= 180 mgkgBB tikus
Peringkat dosis
tertinggi infusa
daun sirsak,
dihitung dengan
menggunakan konsentrasi 6 g 100 ml D x BB = C x V
D x 300 g = 6 g100 ml x 2,5 ml
D = 0,0005 ggBB
D = 500 mgkgBB
Dari kedua dosis tersebut kemudian ditentukan faktor pengali untuk peringkat dosis :
Faktor pengali =
ට
ௗ௦௦ ௧௧ ௗ௦௦ ௧ௗ
షభ
= ට
ହ ଵ଼
యషభ
= 1,67 Peringkat dosis yang diperoleh berdasarkan faktor pengali :
Dosis I = 108 mgkgBB tikus
Dosis II = 180 mgkgBB tikus
Dosis III = 301 mgkgBB tikus
Dosis IV = 503 mgkgBB tikus
6. Pembuatan infusa daun sirsak
Infusa daun sirsak dibuat dengan menimbang sejumlah 6,0 g serbuk kering daun sirsak dengan menambahkan 100,0 ml aquadest. Campuran ini
dipanaskan selama 15 menit dengan suhu 90 C pada heater. Waktu 15 menit
dihitung ketika suhu campuran telah mencapai 90
o
C. Air yang diperoleh kemudian disaring menggunakan kain flanel dan apabila belum mencapai volume
100 ml maka dapat ditambahkan air panas melalui ampas rebusan hingga volume yang diinginkan tercapai.
7. Penyiapan hewan uji
Hewan uji yang digunakan terdiri dari tikus jantan dan betina, galur Sprague-Dawley
, umur 2- 3 bulan, berat badan 170-280 g, berjumlah 50 ekor 25 jantan dan 25 betina disiapkan dan ditempatkan dalam metabolic cage. Pada
setiap metabolic cage berisi satu tikus. Tiga hari sebelum dilakukan perlakuan hewan uji diadaptasikan pada metabolic cage.
8. Pengelompokan hewan uji
Pada penelitian ini digunakan lima puluh ekor tikus, dibagi menjadi lima kelompok secara acak, yaitu satu kelompok kontrol dan empat kelompok
perlakuan, masing-masing kelompok uji terdiri dari sepuluh ekor tikus lima jantan dan lima betina. Kelompok I sampai IV diberi perlakuan infusa daun
sirsak dengan peringkat dosis berturut-turut, yaitu 108; 180; 301; 503 mgkgBB tikus. Kelompok V, yaitu kelompok kontrol negatif diberi aquadest sebanyak
8333 mgkgBB tikus.
9. Prosedur pelaksanaan toksisitas subkronis
Sediaan uji berupa infusa daun sirsak diberikan pada hewan uji sesuai dosis pemberian dengan kekerapan pemberian satu kali sehari selama 30 hari pada
tikus jantan dan betina dengan tetap diberi makan dan minum. Pada awal masa uji yaitu pada hari I, darah semua tikus diambil melalui sinus orbital mata, ditampung
pada Eppendorf berisi heparin untuk diambil serum darah kemudian dilakukan pengukuran kadar glukosa darah tikus. Pengukuran kadar glukosa darah dilakukan
di Parahita Medical Lab. Pemberian infusa daun sirsak dilakukan selama 30 hari pada setiap kelompok perlakuan sesuai dengan peringkat dosis. Pada hari ke 31,
darah semua tikus diambil melalui vena orbital mata, ditampung pada Eppendorf berisi heparin untuk diambil serum darah kemudian dilakukan pengukuran kadar
glukosa darah tikus. 10.
Pengamatan
a. Pengamatan berat badan hewan uji Pengamatan berat badan terhadap hewan uji dilakukan dengan cara
menimbang hewan uji dengan timbangan. Penimbangan berat badan hewan uji dilakukan setiap hari. Perhitungan purata berat badan tikus dilakukan dengan cara
menambahkan berat badan tikus kemudian dibagi dengan jumlah tikus ditiap kelompok dilakukan pada hari 0, 7, 14, 21, 28.
b. Pengukuran asupan pakan hewan uji Hewan uji diberikan asupan pakan setiap hari sebanyak 20 g dan
dilakukan penggantian pakan setiap harinya. Cara mengukur besarnya asupan pakan tikus yaitu dengan menimbang pakan yang diberikan pada hari pertama,
kemudian pada hari kedua pakan yang masih tertinggal pada wadah ditimbang. Selisih penimbangan antara berat pakan hari kedua dengan berat badan hari
pertama, dihitung sebagai asupan makanan yang dihabiskan pada hari pertama. c. Pengukuran asupan minun hewan uji
Hewan uji diberikan minum berupa air reverse-osmosis sebanyak 150 ml. Minuman diberikan dalam wadah botol kaca yang diberi pipa seperti tabung
reaksi yang diberi lubang pada ujungnya. Pengukuran asupan minum hewan uji
dilakukan dengan cara memasukkan 150 ml air pada wadah dihari pertama, kemudian pada hari kedua jumlah sisa air yang masih terdapat dalam botol
dihitung. Air minum yang dihabiskan tikus pada hari pertama dihitung dengan cara mengurangkan jumlah air minum yang diberikan pada hari pertama dengan
jumlah air minum sisa pada hari kedua.
E. Analisis dan Evaluasi Hasil
1. Pemeriksaan kadar glukosa darah Data kadar glukosa darah dianalisis dengan uji Kolmogorov Smirnov
untuk melihat distribusi data tiap kelompok. Apabila distribusi data normal maka analisis dilanjutkan dengan analisis pola searah One Way ANOVA dengan taraf
kepercayaan 95 , kemudian dilanjutkan dengan uji Scheffe untuk mengetahui perbedaan
masing-masing kelompok.
Apabila hasil
analisis dengan
uji Kolmogorov Smirnov
data menunjukkan distribusi yang tidak normal maka analisis dilanjutkan dengan analisis non parametrik, yaitu Kruskal Walis untuk
mlihat perbedaan kadar glukosa darah antar kelompok, dilanjutkan dengan uji Mann Whitney
untuk mengetahui perbedaan uji tiap kelompok. Untuk mengetahui ada tidaknya perbedaan bermakna sebelum dan
sesudah perlakuan dilakukan uji paired-T test untuk tiap kelompok. 2. Pengamatan berat badan hewan uji
Data perubahan berat badan merupakan data pendukung dengan dihitung purata kenaikan berat badan pada hari ke 0, 7, 14, 21, dan pada hari ke 28. Data
perubahan berat dilakukan dianalisis dengan menggunakan General Linier Model dengan metode multivariate.
3. Pengukuran asupan pakan hewan uji Data pengukuran asupan pakan hewan uji dilakukan dengan menghitung
purata harian asupan pakan hewan uji. Setelah 28 hari, profil pola makan dibuat dengan menggunakan grafik.
4. Pengukuran asupan minum hewan uji Data pengukuran asupan minum hewan uji dilakukan dengan menghitung
purata harian asupan minum hewan. Setelah 28 hari, profil pola minum dibuat dengan menggunakan grafik.
61
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian ini bertujuan untuk membuktikan ada tidaknya potensi efek toksik dari infusa daun sirsak. Penelitian ini secara khusus bertujuan untuk
mengungkapkan spektrum efek toksik perubahan biokimia infusa daun sirsak terhadap kadar glukosa darah yang dinilai dari perubahan kadar glukosa darah dan
mengungkapkan kekerabatan antara dosis dengan spektrum efek toksik.
A. Determinasi Tanaman Sirsak
Determinasi tanaman bertujuan untuk menentukan nama atau jenis tanaman dengan spesifik dan tepat karena tumbuhan memiliki berbagai jenis
varietas. Hal ini berguna dalam pemanfaatan tanaman tersebut sehingga tidak menimbulkan masalah. Determinasi dilakukan dengan mencocokkan tanaman
dengan kunci determinasi berdasarkan buku acuan. Hasil determinasi tanaman sirsak dilakukan sampai ketingkat spesies.
Setelah determinasi dilakukan, dapat disimpulkan bahwa tanaman sirsak yang digunakan dalam penelitian ini adalah benar tanaman sirsak dengan nama
ilmiah Annona muricata L.
B. Pembuatan Serbuk dan Penetapan Kadar Air Tanaman Sirsak
Pembuatan serbuk daun sirsak dengan cara mengolah sejumlah 184,0 g daun sirsak basah lalu diproses dengan cara dipetik, dicuci, dan dikeringkan.
Proses pengeringan daun sirsak basah dengan menggunakan oven, suhu yang dipakai ± 50
o
C selama 72 jam. Daun sirsak kering kemudian dibuat serbuk
Kategori