UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
f. Ditambahkan kembali hingga 50 ml larutan Natrium klorida 0,85 saline tahap pencucian TRBC.
g. Diulangi hingga empat kali total empat kali pencucian TRBC. Yang terakhir ditambahkan larutan Natrium klorida 0,85 saline sampai
dengan 45 ml.
h. Dipindahkan TRBC ke dalam botol bertutup conical tube dan disimpan pada suhu 4
o
C dapat bertahan hingga 10 hari. TRBC siap digunakan untuk uji aktivitas hemaglutinasi Praseptiangga, 2012.
3.4.4.4. Uji hemaglutinasi
Uji aktivitas lektin dilakukan terhadap ekstrak dari 9 alga yang di ekstraksi dengan menggunakan Phosphate Buffer Saline.
a. Uji hemaglutinasi dilakukan pada 96 well microtiter V-plate yang kemudian ditambahkan 25 µl larutan Natrium klorida 0,85 saline ke
dalam well secara memanjang mulai dari well nomer 2 sampai 12. microtiter U-plate memanjang : ada 12 well, dan melebar : 8 well.
b. Pipet 50 µl crude ekstrak pada well pertama. Kemudian dibuat serial dilution dari well ke well dengan mengambil 25 µl extract pada well
pertama, kemudian ditambahkan pada well kedua. Selanjutnya, well kedua diresuspensi, kemudian diambil 25 µl untuk ditambahkan pada well
ketiga dan seterusnya.
c. Ditambahkan 25 µl RBC atau TRBC pada tiap well. Lalu dihomogenkan dengan perlahan dan hati-hati selama 30 detik dan diinkubasikan pada
suhu ruang 25
o
C selama 1 jam.. d. Uji hemaglutinasi dikatakan positif + ditandai dengan adanya karpet
pada well, hasil negatif - jika RBC mengendap ke bawah membentuk titik di dasar well Prseptiangga, 2012.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.4.5. Pengukuran Kadar Protein Total Ekstrak Kasar Alga Dengan Metode Bicinchoninic Acid BCA
Pengukuran kadar protein total menggunakan Pierce TM BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific, 2012.
3.4.5.1. Persiapan Standar Bovine Serum Albumin BSA
Kurva standar Bovine Serum Albumin BSA dibuat dengan menggunakan larutan Bovine Serum Albumin. Konsentrasi yang dibutuhkan adalah 0 µgml, 25
µgmL, 125 µgmL, 250 µgml, 500 µgml, 750 µgml, 1000 µgml, 1500 µgml, dan 2000 µgml. Variasi konsentrasi larutan tersebut dibuat dengan menggunakan larutan
standar BSA 2 mgml. Larutan tersebut masing-masing diambil lalu ditambahkan masing-masing pelarut Phosphate Buffer Saline PBS pH 7. Volume BSA dapat
dilihat pada table.3.1. Thermo Scientific, 2012.
Tabel. 3.1. Variasi konsentrasi BSA dari larutan stok 2mgml Vial
Volume pelarut µl
Volume BSA µl Konsentrasi akhir
BSA µgml A
300 dari stok 2000
B 125
375 dari stok 1500
C 325
325 dari stok 1000
D 175
175 dari larutan vial B 750
E 325
325 dari larutan vial C 500
F 325
325 dari larutan vial E 250
G 325
325 dari larutan vial F 125
H 400
100 dari larutan vial G 25
I 400
0 = Blangko
[Thermo Scientific, 2012] Selanjutnya, larutan yang telah diencerkan diambil sebanyak 25 µgml dan
ditambahkan reagen kerja Working Reagen 200 µgml, kemudian dihomogenkan.
