d. Metode ini juga dapat dikaitkan dengan metode penapisan untuk penyaringan
senyawa antikanker dari tanaman
20
2.1.8 Hewan Uji 2.1.8.1 Pemilihan Hewan Uji
Hewan uji dipilih dalam penelitian toksisitas berdasarkan tingkat trofis masing- masing hewan uji pada piramida rantai makanan. Sesuai dengan kebutuhannya
maka penelitian toksisitas ini dapat dilakukan dengan menggunakan organisme akuatik airtawar, organisme terestrial atau organisme laut. Beberapa
pertimbangan pemilihan larva udang sebagai hewan uji: 1.
Telur Artemia: memiliki daya tahan yang lama dapat tetap hidup dalam kondisi kering, selama beberapa tahun, lebih cepat dan mudah menetas
dalam waktu 48 jam sehingga dapat dihasilkan dalam jumlah besar yang siap untuk di uji.
21
2. larva udang memiliki kemampuan untuk mengatasi perubahan tekanan
osmotik dan regulasi ion yang tinggi.
21
3. larva udang memiliki membran kulit yang tipis sehingga kematian suatu larva
akibat efek sitotoksik dari senyawa bioaktif dapat dianalogikan dengan kematian sebuah sel dalam organisme.
21
4. larva udang juga memiliki toleransi yang tinggi terhadap selang salinitas yang
luas, mulai dari air tawar hingga air yang bersifat jenuh garam.
22
2.1.8.2 Artemia salina Leach Brine Shrimp
Kingdom : Animalia
Filum : Arthropoda
Kelas : Crustacea
Subkelas : Branchiophoda
Ordo : Anostraca
Famili : Artemiidae
Genus : Artemia
Spesies : Artemia salina Leach.
Gambar 2.2. Artemia salina Leach Brine Shrimp sumber: aquafisher.org.ua
Artemia merupakan hewan yang hidup di danau-danau garam berair asin dan termasuk kelompok udang-udangan dari filum arthrophoda.hewan ini dapat
toleran hidup pada salinitas yang sangat luas, mulai dari nyaris tawar hingga jenuh garam hal ini dikarenakan biasanya danau tempat Artemia hidup salinitasnya
sangat bervariasi tergantung pada jumlah hujan dan penguapan yang terjadi. Telur Artemia lebih baik ditetaskan pada kadar garam lebih dari 25 karena dalam
kondisi tersebut telur berada dalam kondisi tersuspensi sedangkan kondisi telur tidak bisa menetas dan tenggelam jika kadar garam kurang dari 6.
23
2.1.8.3 Morfologi
Kista Artemia salina Leach setelah ditetaskan dalam waktu 24-48 jam pada salinitas 15-35 ppt akan berubah menjadi larva yang dikenal dengan nama
Nauplius. Nauplius akan berubah betuk sebanyak 15 kali dan setiap satu fase perubahan disebut instar. Nama lain untuk telur larva artemia adalah siste,
merupakan perkembangan lanjut dari embrio yang diselubungi cangkang yang tebal dan kuat sehingga embrio lebih terlindungi dari pengaruh kekeringan,
benturan keras, sinar ultraviolet, dan mempermudah pengapungan.
23
Gambar 2.3 : Larva artemia sumber: Panjaitan bontomi, R. 2011
24
• Instar I: merupakan larva yang baru saja menetas. Warna tubuhnya kemerahan akibat banyak mengandung makanan cadangan dan belum
perlu makan. Sudah memiliki anggota tubuh berupa antena kecil atau antena I dan antena besar atau antena II yang terdapat sepasang rahang.
24
• Instar II: yaitu setelah 24 jam menetas. Larva sudah memiliki mulut, saluran pencernaan dan dubur karena itulah mulai mencari makanan dan
cadangan makanannya sudah mulai habis. Instar II memperoleh makanan dengan menggerakkan antena II.
24
• Instar selanjutnya-XV: terbentuk sepasang mata majemuk, selain itu berangsur-asngsur tumbuh tunas-tunas kakinya. Setelah menjadi instar
XV, kaki sudah lengkap sebanyak 11 pasang, dan mulailah menjadi larva dewasa.
24
• Larva dewasa: artemia dewasa bentuknya telah sempurna dengan ukuran panjang sekitar 1cm dengan kaki atau torakopoda sebanyak 11 pasang.
Pada jantan dan betina, antena I berfungsi sebagai alat peraba. Sedangkan antena besar pada jantan menjadi alat penjepit yang besar dan berotot yang
kegunaannya untuk berpegangan pada betina waktu menjelang perkawinan. Pada betina, antena II mengalami penyusutan.
24
Gambar 2.4 Artemia dewasa jantan dan betina sumberPanjaitan bontomi, R. 2011
24
Artemia digunakan sebagai hewan uji karena memiliki kesamaan tanggapan dengan dengan manusia, yaitu tipe DNA-dependent RNA
polimeraseartemia serupa dengan yang terdapat pada mamalia dan organisme yang memiliki ouabaine-sensitive Na
+
dan K
+
dependent ATPase. DNA-dependent RNA polymerase merupakan DNA yang mengarahkan proses transksripsi RNA
yang bergantung pada RNA polymerase. Jika RNA polymerase itu dihambat, maka DNA tidak dapat mensisntesis tidak dapat mensintesis RNA dan RNA tidak
dapat terbentuk sehingga sintesis protein juga dihambat. Jika protein tidka terbentuk, metabolisme sel dapat terganggu sehingga dapat mengakibatkan
kematian sel.
24
Artemia juga memiliki ouabaine-sensitive Na
+
dan K
+
dependent ATPase. Na
+
dan K
+
dependent ATPase merupakan enzim yang mengkatalis hidrolisis ATP menjadi ADP serta menggunakan energi untuk mengeluarkan 3Na
+
darisel dan mengambil 2K
+
kedalam. Fungsi dari ouabaine adalah menghambat aktivitas enzim tersebut dan menyebabkan keseimbangan ion Na
+
dan K
+
tetap terjaga.Suatu senyawa toksik pada ekstrak tanaman akan bekerja mengganggu
kerja salah satu enzim ini dan menyebabkan kematian artemia.
24
2.1.7.4Siklus Hidup
Gambar 2.5. Siklus Hidup Artemia sumber: Ambas, Zaldi. pakan alami: Artemia Klasifikasi Morfologi. 2010
Siklus Artemi terdiri dari dua tahap. Tahap pertama dimulai saat menetasnya telur atau kista. Selanjutnya akan menetas menjadi embrio pada suhu
25 C setelah 15-20 jam, tetapi masih dalam bentuk yang tidak sempurna karena
embrio ini masih menempel pada kulit kista, namun setelah beberapa jam kemudian memasuki fase selanjutnya yaitu berubah menjadi nauplius yang
bewarna orange kecoklatan yang sudah dapat berenang bebas. Pada awalnya nauplius masih tidak memiliki anus dan mulut sehingga pada tahap ini tidak dapat
makan. Lalu setelah 12 jam akan menetas dan berganti kulit, setelah itu memasuki tahap larva kedua.
23
Pada tahap ini, nauplius sudah dapat mengkonsumsi makanan berupa mikro alga, bakteri, dan detritus organik lainnya. delapan hari kemudian berubah
menjadi dewasa dan selama masa itu berganti kulit sebanyak 15 kali. Artemia dewasa menetaskan kista dan pertumbuhannya pada temperatur suhu 25
o
C-30
o
C, namun dapat toleran terhadap selang suhu -18
o
C – 40
o
C. Dapat hidup didalam air tawar selama 5 jam sebelum akirnya mati. PH optimum adalah antara 8-9 karena
pH dibawah 5 atau diatas 10 dapat membunuh artemia.
23
Dalam fase ini mereka akan mulai makan dengan pakan berupa mikro alga, bakteri, dan detritus organik lainnya. Nauplius akan berganti kulit sebanyak 15
kali sebelum menjadi dewasa dalam waktu 8 hari. Artemia dewasa rata-rata berukuran 8 mm, meskipun demikian pada kondisi yang tepat mereka dapat
mencapai ukuran sampai dengan 20 mm. Artemia yang baik adalah yang bewarna kuning atau merah jambu, dan untuk mencapai hal tersebut artemia diberikan
cahaya minimal yang diperlukan dalam proses penetasan dan akan sangat menguntungkan bagi pertumbuhannya. Kadar oksigen juga harus dijaga dengan
baik untuk pertumbuhan artemia.
17
2.1.8.5Penetasan Kista
Penentasan kista artemia dapat dilakukan dengan 2 cara, yaitu penetasan langsung dan cara dekapsulasi. Cara dekapsulasi memang bukan cara yang umum,
namun memiliki keunggulan yaitu dapat meningkatkan daya tetas dan menghilangkan penyakit yang dibawa oleh cystae artemia. Cara ini dilakukan
dengan mengupas bagian luar kista menggunakan larutan hipoklorit tanpa mempengaruhi kelangsungan hidup embrio.
24
Beberapa syarat yang diperlukan agar kista Artemia salina dapat ditetaskan secara optimal:
• salinitas antara 20-30 ppt parts per thousand atau 1-2 sendok teh garam per liter air tawar dan suhu air 26-28 °C
• memberikan sinar lampu pada saat penetasan • aerasi yang cukup
Aerasi pada uji BSLT bertujuan untuk terjadinya perpindahan senyawa sehingga terjadi kontak atara air dan udara. Dengan cara ini, proses aerasi dapat
meningkatkan jumlah O
2
didalam air, menghilangkan CO
2
, H
2
S, dan menghiangkan rasa serta bau yang disebabkan oleh zat-zat organik. Selain itu,
aerasi juga dapat meningkatkan pH dan menurunkan suhu termal air laut. alam 24 jam, larva udang membutuhkan proses aerasi dengan menggunakan aeratorselama
proses inkubasi. Aerasi bertujuan terjadi perpindahan senyawa yang bersifat volatile dengan prinsip terjadinya kontak antara air dan udara sehingga Proses
aerasi dapat meningkatkan jumlah O
2
didalam air, menghilangkan CO
2
, H
2
S dan menghilangkan rasa serta bau yang disebabkan oleh zat-zat organik. Manfaat lain
dari aerasi juga dapat meningkatkan pH dan menurunkan suhu termal air laut.
24
Proses aerasi dapat dilakukan dengan dua cara: 1.
Dengan memompakan udara atau oksigen kedalam air sehingga dihasilkan gelembung udara yang berkontak langsung dengan air.
24
2. Menekan air keatas untuk berkontak langsung dengan udara proses tersebut
dilakukan dengan bantuan pemutaran pemutaran baling-baling pada permukaan air.
24
2.2.Kerangka Konsep
Ekstrak Daun Garcinia benthamiPierre
Memiliki senyawa bioaktif
Menghambat aktivitas radikal bebas
Berperan sebagai antioksidan
Berpotensi sebagai obat herbal antikanker
Berkolerasi dengan tingginya kandungan toksik
Uji toksisitas tingkat I uji
toksisitas akut BSLT 24 jam
Metode meyer: melihat tingkat
mortalitas hewan berderajat rendah
larva Artemia salina Leach
setelah penambahan
ekstrak Didapatkan data:
-persentase kematian -nilai probit
-log konsetrasi
Persamaan linear: Y =a+bx
Nilai LC
50
1000 ppm
senyawa toksik
2.3.Definis Operasional
No Variabel
Definisi Cara ukur
Alatukur Skalaukur
Hasilukur
1. Konsentras
i ekstrak
etil asetat
daun Garcinia
Konsentrasilarut anujidalam ppm
1 μgmL V1M1=V2M2
perbandinganμ gekstrakdengan
mL etil asetat -
Numerik 50 ppm,
100 ppm, 200ppm,
500ppm, 1000 ppm
2. 3.
LC
50
prosentase kematian
larva Artemia
salina Nilai yang
menunjukankon sentrasiekstrak
ppm yang mampu
mematikan larva sebanyak
50 Jumlah larva
yang mati setelah 24 jam
dibandingkan dengan jumlah
larva uji Persamaanregre
si linier dengananalisa
probit. Jumlah larva
mati jumlah larva uji
kemudian dikalikan 100
-
- Kategorik
Numerik Sangat
toksik 30 ppm, toksik:
30-1000 ppm, dan
tidak toksik 1000 ppm
Akan dicocokkan
dalam tabel probit
kemudian dijadikan
variabel terikat dalam
analisis probit
25
BAB 3 METODE PENELITIAN
3.1Desain Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan post test only control group design di laboratorium, yaitu pemberian ekstrak etil asetat daun
Garcinia benthami Pierre terhadap larva Artemia salina Leach melalui metode BSLT.
3.2 Waktu dan Lokasi Penelitian
Penelitian dilakukan kurang lebih selama lima bulan, yaitu dimulai dari Januari
– Agustus 2013. Lokasi penelitian di laboratorium Farmakognosi dan Fitofarmaka, laboratorium Farmakologi, dan laboratorium Biologi Fakultas
Kedokteran dan Ilmu Kesehatan FKIK Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.
3.3Populasi dan sampel 3.3.1Populasi
Populasi penelitian ini adalah larva Artemia Salina Leach yang berasal dari laboratorium kimia LIPI, Bogor dan didapatkan pada bulan Maret 2013.
Sebelum menjadi larva, telur Artemia salina Leach direndam dengan air laut. Suhu penetasan adalah ± 25
–30
o
C dan larvanya disebut nauplius. Larva ini siap untuk uji BSLT setelah berumur 48 jam.
3.3.2Besar Populasi
Larva Artemia salina Leach yang digunakan berjumlah 10 ekor pada setiap kelompok dalam sekali perlakuan. Pada penelitian ini, terdapat lima kelompok
perlakuan dimana akan dilakukan replikasi tiga kali triplo untuk tiap kelompok perlakuan dan jumlah sampel yang diperlukan adalah 150 ekor larva. Selain itu,