3.4 Alat dan bahan 3.4.1 Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah blender, tabung hitam, gelas ukur, pisau, tabung reaksi, mikro pipiet 2-
20 μL, mikro pipet 20-200 μL, mikro pipet 100-1000 μL, cawan penguap, batang pengaduk kaca, neraca
analitik, pipet, kaca pembesar, vial atau botol kaca, kotak penetasan larva udang, alumunium foil, pengatur udara, dan lampu.
3.4.2Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun Garcinia benthami Pierre yang diperoleh dari Kebun Raya Bogor pada bulan
Maret 2013, etil asetat, aquadest, larva Artemia salina Leach, dan air laut.
3.5 Cara Kerja Penelitian 3.5.1 Penyiapan Bahan
Pembuatan ekstrak daun Garcinia benthami Pierredimulai dengan pengumpulan bahan daun segaryang diperoleh dari Kebun Raya bogor pada bulan
Februari 2013 sebanyak 6 kg. Selanjutnya, daun segar dikeringkan di Balai Penelitian Tanaman Rempa dan Obat BALITRO, Bogor dengan menggunakan
oven, selama 5 hari. Pengeringan ini dilakukan disana agar proses tersebut dilakukan dalam keadaan terawasi untuk mencegah terjadinya perubahan kimia
yang terlalu banyak. Daun yang sudah kering didapatkan jumlah 3 kilogram.
4
Daun kering yang didapatkan dipilih dan dibersihkan dari kotoran- kotoran yang tertinggal. Setelah daunnya kering, mula-mula dibersihkan bagian
permukaannya. Pada tahap ini satu yang harus diperhatikan adalah daun Garcinia benthami Pierre tidak dijangkit oleh mikroba dan mikroorganisme seperti virus,
bakteri atau jamur. Lalu dipotong menjadi bagian yang kecil-kecil dan dihancurkan dengan blender namun dalam bentuk yang tidak terlalu halus dan
didapatkan 1 kg serbuk simplisia.
4
3.5.2 Pembuatan Ekstrak
Serbuk simplisia daun Garcinia benthami Pierre yang digunakan dalam percobaan sebesar 800 gram. Ekstrak dibuat dengan metode maserasi, caranya
merendam simplisia dalam pelarut etil asetat selama 48 jam, disaring dengan kertas saring, kemudian ampas direndam kembali dalam etil asetat dalam waktu
yang sama sampai tersaring atau terekstraksi sempurna. Sebelumnya, etil asetat yang digunakan untuk maserasi terlebih dahulu didestilasi selama 7 hari. Bila
ampas jaringan pada ekstraksi ulang sama sekali tidak bewarna hijau lagi, dapat dianggap semua senyawa berbobot molekul rendah telah terekstraksi. Setelah itu
filtrat tersisa diuapkan dengan alat rotary evaporator pada suhu 41
o
C sehingga didapatkan ekstrak kental etil asetat.
4
Karena pada penelitian ini menggunakan metode maserasi berjenjang, yaitu menggunakan beberapa pelarut yang memiliki sifat kepolaran yang berbeda,
maka proses diatas dilakukan dengan tiga pelarut yang berbeda. Perbedaan polaritas dimaksudkan agar seluruh kandungan senyawa metabolit sekunder
dalam sampel terekstraksi. Pelarut pertama yang dipakai adalah n-heksan yang memiliki sifat non polar, dilakukan perlakuan yang sama sampai ditemukan warna
n-heksan menjadi bening.
4
Kemudiansisa ampas hasil maserasi n-heksan, dipakai kembali untuk maserasi dengan pelarut etil asetat yang memiliki sifat semipolar. Apabila telah
ditemukan warna etil asetat bening kembali, terakhir lakukan maserasi pada ampas dengan pelarut yang bersifat polar, yaitu metanol sampai warna metanol
bening kembali.
4
3.5.3 Penyiapan larva
Penyiapan larva Artemia salina Leach dilakukan dengan menetaskan telur udang 48 jam, yaitu merendam telut tersebut dalam air laut secukupnya
dalam wadah sebelum dilakukan uji. Wadah dibagi menjadi dua bagianoleh steroform di lubangkan pada dua sisinya, yaitu bagian gelap dan terang. Bagian
gelap adalah yang ditutupi oleh alumunium foil tempat dimasukkannya telur larva Artemia salina Leach. Selanjutnya, telur ditimbang sebanyak 1 gram
dandimasukkan ke dalam1 liter air laut. Bagian wadah yang tidak ditempati telur udang diberi penerangan dengan sinar lampu. Larva berumur 48 jam siap
digunakan untuk uji toksisitas akut.
5
3.5.5 Pembagian konsentrasi
Setelah dilakukan orientasi dosis, kemudian ditentukan rentang konsentrasi yang digunakan, Ektrak daun Garcinia bentami Pierre ditimbang
sebesar 250 mg kemudian dimasukkan kedalam labu ukur 250 mL. Setelah itu, masukkan aquades sampai batas garis gelas ukur dan diputar atau dikocok ke atas
dan bawah sampai sudah tercampur seluruhnya dan hasilnya merupakan konsetrasi 1000ppm, sebagai larutan A. Untuk konsentrasi 500ppm, ambil 12,5
mLdari larutan A lalu pindahkan ke labu ukur 25 mL beri aquades didapatkan larutan B. Perlakuan yang sama juga diberikan untuk membuat konsetrasi 200ppm
larutan C, yaitu dengan mengambil 5 ml larutan A ke dalam labu ukur 25 mL dan beri aquades. Untuk pembuatan konsentrasi 100ppm atau larutan D, ambil
sebanyak 2,5 mL dan konsetrasi 50ppm atau larutan E ambil sebanyak 1mL dan masukkan masing-masing kedalam labu ukur lalu beri aquades.
5
3.5.6 Pelaksanaan Uji Toksisitas
Pelaksanaan uji dilakukan dengan mula-mula memasukkan 10 larva udang yang berumur 48 jam kedalam masing-masing tabung. Kedalamnya
dimasukkan ekstrak daun Garcinia benthami Pierre sebanyak 1 mL dari setiap masing-masing konsentrasi dan tambahkan air laut sebanyak 9 mL sehingga
volume masing-masing tabung 10 dan diletakkan selama 24 jam dibawah penerangan yang cukup.
5
Pada penelitian ini larva udang dibagi menjadi lima kelompok perlakuan secara acak, lalu ditambahkan ekstrak etil asetat daun Garcinia
benthami Pierre. Kemudian ditambahkan air laut sebayak 9 mL. Namun, ditambahkan air laut dalam tabung hingga volumenya mencapai 10 mL, maka
konsentrasi ekstrak yang di teteskan juga mengalami pengenceran. Hal tersebut berarti mengencerkan nilai konsentrasi sehingga masing-masing dari nilai
konsentrasi dibagi 110 sesuai dengan banyaknya volume cairan dalam tabung. pada penelitian ini dilakukan pengulangan sebanyak 3 kalitriplo.Setelahnya,
dihitung dan menentukan larva udang yang mati dengan menggunakan kaca pembesar, yaitu bila larva udang tidak menunjukkan pergerakan selama observasi,
maka masukkan kedalam kriteria udang yang mati.
5
3.5.7 Alur Penelitian
= tidak dilakukan
Gambar 3.1 : Bagan Alur Ekstraksi Daun Garcinia benthami Pierre Daun basah Garcinia benthami Pierre 6
kilogram
Dikeringkan dengan oven di LIPI Bogor 3 kilogram
Disortasi, dirajang, dikeringkan, dihaluskan dengan blender dan disaring
Simplisia Garcinia benthami Pierre800 gr
Ekstraksi dengan metode maserasi selama 48 jam
dengan pelarut etil asetat sebanyak 5 L
Ekstrak n-heksan Maserasi bertingkat
ke-1 uji toksisitas akut
maserasi dengan n-heksan, disaring, dievaporasi
ampas
disaring evaporasi
ampas
Ekstrak etil asetat 9, 63 gr
Maserasi dengan metanol,disaring
dievaporasi Ekstrak metanol
Uji toksisitas akut
Gambar 3.2 : Bagan Penyiapan larva Artemia salina Leach Menetaskan telur Artemia salina Leach
1 gram dalam air laut dalam wadah Wadah dibagi steroform lubangkan
pada dua sisinya menjadi dua bagian:
gelap terang
Ditutupi alumunium foil tempat dimasukkannya telur udang
Diberi penerangan sinar lampu
Larva berumur 48 jam uji toksisitas akut
Gambar 3.3: Pelaksanaan Uji Toksisitas Ektrak daun Garcinia benthami Pierre
ditimbang 250 mg
• Dimasukkan kedalam labu ukur • Beri aquades sampai batas garis labu
ukur • Dikocok-kocok
Konsentrasi induk 1000 ppm
Ambil 12,5 ml ke labu
ukur 25 ml Sisa
konsentrasi 100 ppm
Konsentrasi 5 ppm
Beri aquades Ambil 1,25
ml ke labu ukur 25 ml
Ambil 2,5 ml ke labu
ukur 25 ml Ambil 5 ml
ke labu ukur 25 ml
Beri aquades Beri aquades
Konsentrasi 20 ppm
Konsentrasi 10 ppm
Beri aquades Konsentrasi 5
ppm
Kelompok A Kelompok C
Kelompok D Kelompok B
Kelompok E
3.6 Managemen Data
Data hasil penelitian akan diolah dan disajikan dalam bentuk tabel dan grafik. Data dari uji toksisitas tersebut akan dianalisis dengan analisis probit
menggunakan Microsoft Excel 2010 for windows untuk mengetahui harga LC
50,
perumusan probit sederhana untuk membandingkan hasil LC
50
dengan perhitungan analisis probit, dan menggunakan SPSS 16.0 for windows untuk menentukan
normalitas distribusi data.
5
35
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Ekstraksi
Pada penelitian ini, pembuatan ekstrak daun Garcinia benthami Pierre dilakukan dengan metode maserasi berjenjang. Tujuannya adalah agar seluruh
senyawa dalam daun Garcinia benthami Pierre dapat terekstraksi seluruhnya. Pemilihan metode maserasi dikarenakan relatif sederhana yaitu tidak memerlukan
alat-alat yang rumit, mudah, murah, dan dapat menghindari rusaknya komponen senyawa akibat panas.
Namun metode ini memiliki kekurangan dimana membutukan waktu yang lebih lama, pelarut yang lebih banyak, dan penyaringan
yang tidak sempurna.
25
Pada awalnya, Simplisia daun Garcinia benthami Pierre diambil sebanyak 1000 gram dan dimaserasi dengan n-heksan sebanyak 7 kali.
Selanjutnya hasil maserasi disaring dan dievaporasi menggunakan rotary evaporator untuk menguapkan n-heksan, didapatkan ekstrak kental n-heksan daun
Garcinia benthami Pierre. Ampas dari n-heksan dilakukan kembali maserasi, yaitu dengan
menggunakan pelarut etil asetat sebanyak 10 liter. Maserasi dilakukan sebanyak 5 kali dalam 10 hari. Setelahnya, hasil maserasi disaring dan filtrat dipekatkan
dengan rotary evaporator pada suhu rata-rata 41
o
C sehingga didapatkan ekstrak etil asetat daun Garcinia benthami Pierre sebesar 9,63 gram.
Terhadap ampas dari etil asetat pun dilakukan maserasi dengan pelarut metanol. Namun pada penelitian kali ini hanya menggunakan pelarut etil asetat
dan proses maserasi pelarut n-heksan dan metanol dilakukan oleh peneliti lain. Rendemen setiap ekstrak dihitung dengan membandingkan bobot ekstrak yang
diperoleh dengan simplisia. Rendemen : B x 100
A
