4
2.3 Perhitungan Total Padatan Terlarut Prebiotik
Perhitungan total padatan terlarut TPT mengacu pada Apriyantono et al. 1989 yang bertujuan untuk melihat kepekatan padatan terlarut yang berguna
pada analisis oligosakarida. Cawan porselin dimasukkan ke dalam oven selama 30 menit lalu didinginkan dalam desikator selama 10 menit kemudian ditimbang a
gram. Setelah itu sebanyak 1 ml oligosakarida yang diekstraksi dari ubi jalar ditempatkan dalam cawan porselin tersebut lalu ditimbang b gram dan
dimasukkan ke dalam oven selama 24 jam dengan suhu 100
o
C. Setelah kering, cawan tersebut didinginkan dalam desikator selama 10 menit hingga berat cawan
stabil lalu ditimbang c gram. Total padatan terlarut dihitung dengan rumus: TPT =
− −
× 100
2.4 Penyediaan Suspensi Bakteri Streptococcus agalactiae
Penyediaan bakteri S. agalactiae dilakukan dua kali pengkulturan. Sebanyak satu ose biakan S. agalactiae dikultur dalam 10 ml media BHI Brain Heart
Infusion steril selama 24 jam. Setelah itu, hasil kultur bakteri diambil sebanyak 1 ml untuk dikultur kembali dalam 24 ml media BHI steril selama 24 jam.
Kepadatan bakteri S. agalactiae setelah dikultur yaitu 10
9
cfuml.
2.5 Pengujian Sinbiotik Secara In Vivo
2.5.1 Persiapan Wadah dan Ikan Uji
Wadah yang digunakan dalam penelitian ini adalah 12 akuarium yang disekat menggunakan kaca menjadi dua bagian dengan ukuran 100 cm x 40 cm x
35 cm. Akuarium yang digunakan sebelumnya dicuci bersih dan didesinfeksi dengan kaporit 100 ppm selama 24 jam lalu dibilas hingga bersih dan
dikeringkan. Setelah itu setiap akuarium diisi air hingga ketinggian 25 cm lalu diberi aerasi. Pada bagian luar akuarium ditutup dengan plastik hitam agar ikan
tidak mengalami stres dan bagian atas akuarium ditutup dengan kasa agar ikan tidak keluar dari wadah.
Ikan nila yang digunakan berasal dari Parung Kuda, memiliki bobot rata- rata 13,43±2,97 g dipelihara dengan kepadatan 10 ekorakuarium dimana setiap
akuarium diberi heater. Peletakan akuarium disusun secara acak. Ikan uji terlebih
5
dahulu diaklimatisasi terhadap pakan uji dan lingkungan selama 1 minggu. Setelah itu ikan dipuasakan selama 1 hari sebelum diberikan perlakuan pakan.
Pemeliharaan ikan nila dilakukan selama 30 hari dan sampling dilakukan setiap 10 hari.
2.5.2 Uji In Vivo
Pakan uji yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari pakan buatan Lampiran 1 dengan formulasi yang mengacu pada Putra 2010 dan pakan
komersil dengan merk dagang FF 999 Lampiran 1. Penambahan sinbiotik pada pakan terdiri dari 1 probiotik Wang, 2007 NP5 dan 2 prebiotik Mahious,
2006. Penelitian ini terdiri dari 6 perlakuan dengan 2 ulangan, yaitu: Kontrol positif K+
: Pemberian pakan buatan tanpa sinbiotik dan diuji tantang dengan S. agalactiae
Kontrol negatif K- : Pemberian pakan buatan tanpa sinbiotik
Sinbiotik : Pemberian pakan buatan dengan penambahan sinbiotik
dan diuji tantang dengan S. agalactiae Kontrol positif K+
: Pemberian pakan komersil tanpa sinbiotik dan diuji tantang dengan S. agalactiae
Kontrol negatif K- : Pemberian pakan komersil tanpa sinbiotik
Sinbiotik : Pemberian pakan komersil dengan penambahan sinbiotik
dan diuji tantang dengan S. agalactiae
Probiotik, prebiotik, dan 2 kuning telur Wang, 2007 ditambahkan ke wadah mortar kemudian pakan yang telah ditimbang dimasukkan ke wadah
tersebut lalu diaduk hingga merata dengan menggunakan sendok kemudian didiamkan selama 15 menit. Pemberian pakan dilakukan 3 kali dalam sehari
secara at satiation atau sekenyangnya. Penyiponan dan pergantian air dilakukan pada pagi hari sebanyak 60 dari total volume akuarium. Pengukuran suhu
dilakukan setiap hari sedangkan pengukuran DO, pH, dan TAN dilakukan 3 kali selama pemeliharaan.
Jumlah ikan saat uji tantang menjadi 6 ekor tiap akuarium dari 10 ekor tiap akuarium. Hal ini berdasarkan jumlah ikan terendah setelah perlakuan pakan dari
6
tiap akuarium serta karena bertambahnya ukuran ikan. Ikan yang telah diberi perlakuan pakan selama 30 hari diuji tantang bakteri S. agalactiae dengan
kepadatan 10
9
cfuml dan dosis yang disuntikkan sebanyak 0,1 ml10 g bobot ikan. Ikan yang diuji tantang bakteri S. agalactiae yaitu pada perlakuan kontrol
positif dan sinbiotik. Sedangkan perlakuan kontrol negatif disuntik dengan PBS sebanyak 0,1 ml10 g bobot ikan. Skema uji in vivo dapat dilihat pada Gambar 1
di bawah ini.
Gambar 1. Skema uji in vivo Keterangan: A = Pengamatan hematologi ikan nila sebelum perlakuan pakan
B = Pengamatan hematologi ikan nila setelah perlakuan pakan C = Pengamatan hematologi ikan nila setelah uji tantang
2.6 Parameter Pengamatan 2.6.1 Tingkat Kelangsungan Hidup
Survival Rate
Penghitungan jumlah ikan dilakukan pada akhir pemeliharaan dan akhir uji tantang. Tingkat kelangsungan hidup ikan nila dihitung dengan menggunakan
rumus berikut Effendie, 1997: SR =
�� �
× 100 Keterangan : SR = Tingkat kelangsungan hidup
Nt = Jumlah ikan pada akhir perlakuan No = Jumlah ikan pada awal perlakuan
2.6.2 Laju Pertumbuhan Harian
Laju pertumbuhan harian dihitung menggunakan rumus berikut Huisman, 1987 :
LPH hari =
�� �
− 1 × 100
H1 H30
H32 Perlakuan pakan selama 30 hari
H31 Uji tantang
Pengamatan kematian ikan
A B
C H37
7
Keterangan : Wt = Bobot rata-rata ikan pada akhir pemeliharaan gram Wo = Bobot rata-rata ikan pada awal pemeliharaan gram
n = Waktu pemeliharaan
2.6.3 Efisiensi Pakan
Efisiensi pakan dihitung dengan menggunakan rumus Takeuchi, 1988: EP = {Pertambahan bobot ikan gram Jumlah konsumsi pakan gram} x 100
2.6.4 Hematologi Ikan
Pengamatan hematologi ikan dilakukan sebanyak 3 kali yaitu sebelum perlakuan pakan H0, setelah perlakuan pakan H30, dan diakhir masa uji
tantang H37. Sebelumnya, syringe dan eppendorf dibilas dengan Na-sitrat 3,8 untuk mencegah pembekuan darah. Darah ikan diambil melalui vena caudal
menggunakan syringe. Darah yang telah diambil kemudian dimasukkan ke dalam eppendorf secara perlahan. Parameter hematologi ikan yang diamati adalah total
eritrosit dan total leukosit Blaxhall dan Daisley, 1973, hematokrit Anderson dan Siwicki, 1993, hemoglobin Wedemeyer dan Yasutake, 1977, diferensial
leukosit Amlacher, 1970, dan indeks fagositik Anderson dan Siwicki, 1993.
2.6.4.1 Perhitungan Eritrosit
Darah dihisap menggunakan pipet bulir merah sampai skala 0,5 lalu diencerkan dengan larutan Hayem sampai skala maksimum 101. Kedua ujung
ditutup sejajar kemudian digoyangkan membentuk angka 8 selama 3-5 menit. Setelah itu, tetesan darah yang pertama dibuang lalu darah tersebut diteteskan ke
haemocytometer yang telah ditutup dengan gelas objek pada bagian yang berlekuk. Perhitungan dilakukan di bawah mikroskop dengan perbesaran 400x
dan jumlah eritrosit dihitung pada 5 kotak besar pada haemocytometer dengan faktor pengencer 202. Berikut ini adalah rumus perhitungan jumlah eritrosit :
Σ Eritrosit = rataan Σ sel terhitung x 1
volume kotak besar x faktor pengencer
8
2.6.4.2 Perhitungan Hemoglobin
Perhitungan kadar hemoglobin Hb diawali dengan HCl 0,1 N dimasukkan ke dalam Hb meter sampai skala 10 skala merah menggunakan pipet. Setelah itu
darah dihisap menggunakan pipet Sahli hingga skala 0,2 ml lalu dimasukkan ke dalam tabung Hb meter dan dibiarkan sambil diaduk selama 3-5 menit dan
dincerkan dengan ditambahkan akuades sedikit demi sedikit hingga warnanya sama dengan warna standar yang ada pada tabung Hb meter. Kadar hemoglobin
dilihat pada skala berwarna kuning yang dinyatakan dalam satuan gram per 100 ml darah.
2.6.4.3 Perhitungan Hematokrit
Darah dihisap dengan tabung kapiler mikrohematokrit hingga ¾ bagian tabung lalu ujung tabung ditutup dengan ditancapkan pada crytoceal. Setelah itu,
tabung mikrohematokrit yang berisi darah disentrifuse pada kecepatan 3000 rpm selama 5 menit lalu dilihat endapan darahnya. Pengukuran kadar hematokrit
dengan cara membandingkan panjang endapan darah a terhadap panjang total seluruh darah b. Rumus pengukuran kadar hematokrit dapat dilihat pada rumus
berikut : Kadar hematokrit =
a b
x 100
2.6.4.4 Perhitungan Leukosit
Darah dihisap menggunakan pipet bulir putih sampai skala 0,5 lalu diencerkan dengan larutan
Turk’s sampai skala maksimum 11. Kedua ujung ditutup sejajar kemudian digoyangkan membentuk angka 8 selama 3-5 menit.
Setelah itu, tetesan darah yang pertama dibuang lalu darah tersebut diteteskan ke haemocytometer yang telah ditutup dengan gelas objek pada bagian yang
berlekuk. Perhitungan dilakukan di bawah mikroskop dengan perbesaran 400x dan jumlah eritrosit dihitung pada 5 kotak besar pada haemocytometer dengan
faktor pengencer 22. Berikut ini adalah rumus perhitungan jumlah leukosit : Σ Leukosit = rataan Σ sel terhitung x
1 volume kotak besar
x faktor pengencer
9
2.6.4.5 Diferensial Leukosit
Darah diteteskan pada gelas objek untuk dibuat preparat ulas darah. Setelah itu, preparat ulas darah dikeringudarakan. Preparat ulas darah yang sudah kering,
difiksasi dalam larutan methanol selama 5 menit lalu dikeringudarakan. Setelah preparat ulas darah kering, kemudian direndam dalam larutan Giemsa selama 10-
15 menit lalu dibilas dengan akuades dan dikeringudarakan. Setelah itu, preparat ulas dapat diamati di bawah mikroskop kemudian jenis-jenis leukosit yang tampak
dihitung hingga berjumlah 100 sel. Persentase masing-masing jenis leukosit dapat dilihat pada rumus berikut :
Jenis leukosit = Jenis leukosit terhitung
100 × 100
2.6.4.6 Indeks Fagositik
Darah diambil sebanyak 50 µ l dan dimasukkan ke dalam eppendorf. Setelah itu ditambahkan sebanyak 50 µl suspensi Staphylococcus aereus dalam PBS lalu
dicampur hingga homogen dan diinkubasi dalam suhu ruang selama 20 menit. Kemudian diambil sebanyak 5 µ l untuk dibuat preparat ulas dan
dikeringudarakan. Preparat ulas yang telah kering, difiksasi dalam larutan methanol selama 5-10 menit lalu dikeringudarakan. Kemudian preparat ulas
direndam dalam larutan selama 10-15 menit lalu dibilas dengan akuades dan kembali dikeringudarakan. Setelah itu, preparat ulas dapat diamati di bawah
mikroskop dan dihitung persentase sel hemosit yang aktif memfagosit hingga berjumlah 100 sel hemosit. Adapun perhitungan indeks fagositik dapat dilihat
pada rumus berikut : Indeks fagositik =
Σ sel hemosit yang aktif memfagosit Σ sel hemosit
x 100
2.6.5 Kualitas Air
Kualitas air diukur pada saat awal, tengah, dan akhir perlakuan pakan. Parameter yang diukur adalah suhu, oksigen terlarut, pH, dan TAN. Tabel 1 di
bawah ini adalah satuan dan alat pengukuran dari parameter kualitas air yang diukur.
10
Tabel 1. Satuan dan alat ukur dari parameter kualitas air Parameter
Satuan Alat ukur
Suhu
o
C Termometer
Oksigen terlarut mgℓ
DO meter pH
- pH meter
Amonia mgℓ
Spektrometer
2.7 Analisi Data
Penelitian ini menggunakan rancangan acak faktorial dengan dua ulangan. Data kelangsungan hidup, laju pertumbuhan harian, efisiensi pakan, dan
hematologi ikan yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan SPSS 16.0 dan uji lanjut Duncan sedangkan data kualitas air dianalisis secara deskriptif.
III. HASIL DAN PEMBAHASAN
3.1 Hasil 3.1.1 Kelangsungan Hidup
Kelangsungan hidup ikan nila diamati selama perlakuan pakan dan selama uji tantang. Kelangsungan hidup ikan nila selama perlakuan pakan dapat dilihat
pada Gambar 2 di bawah ini.
Keterangan: Huruf superscript yang sama menunjukkan hasil yang tidak berbeda nyata P0,05.
Gambar 2. Kelangsungan hidup ikan nila selama 30 hari perlakuan pakan Kelangsungan hidup tertinggi berdasarkan jenis pakan yaitu sebesar 100
pada perlakuan pakan buatan yang diberi sinbiotik dan kontrol negatif pada pakan komersil. Sedangkan kelangsungan hidup terendah berdasarkan jenis pakan yaitu
pada perlakuan kontrol positif dan kontrol negatif pakan buatan sebesar 90. Selain itu pada kontrol positif pakan komersil sebesar 80. Berdasarkan analisis
statistik kelangsungan hidup ikan nila selama 30 hari perlakuan pakan Lampiran 2 menunjukkan hasil yang tidak berbeda nyata P0,05 antara perlakuan pakan
buatan dengan pakan komersil baik yang diberi sinbiotik maupun kontrol. Kelangsungan hidup ikan nila setelah diuji tantang dengan S. agalactiae
dapat dilihat pada Gambar 3. Kelangsungan hidup ikan nila tertinggi setelah uji tantang adalah pada kontrol negatif pakan buatan sebesar 100 dan kontrol
negatif pakan komersil sebesar 91,67. Pada perlakuan sinbiotik pakan buatan dan pakan komersil adalah 83,33, sedangkan kelangsungan hidup pada
perlakuan kontrol positif pakan buatan dan pakan komersil yaitu sebesar 25.
90 90
100 80
100 95
20 40
60 80
100
K+ K-
Sinbiotik
Kel a
n gs
u n
ga n
h id
u p
Perlakuan
pakan buatan pakan komersil
a a a a
a a