Bahan dan Alat Penelitian .1 Bahan Penelitian Skema Alur Penelitian Analisis Data

- Koloni Aggregatibacter actinomycetemcomitans adalah bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans yang berasal dari stem cell Aggregatibacter actinomycetemcomitans Serotipe-C dan kemudian dikultur pada media TSA dalam suasana anaerob. - KHM Konsentrasi Hambat Minimum adalah konsentrasi minimum bahan coba yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri setelah diinkubasi selama 24 jam dan mulai tidak tumbuh koloni bakteri pada media pembenihan dengan menggunakan metode dilusi. - KBM Konsentrasi Bakterisidal Minimum adalah konsentrasi minimum bahan coba yang dapat membunuh 99,9 atau 100 bakteri setelah dilakukan uji dilusi selama 24 jam, dengan cara menghitung jumlah koloni bakteri pada media padat dengan menggunakan metode Drop Plate Mills Mesra. 3.6 Bahan dan Alat Penelitian 3.6.1 Bahan Penelitian - Buah jeruk purut sebanyak 2000 gram - Pelarut etanol 96 sebanyak 5 liter Kimia Farma, Indonesia - Suspensi Aggregatibacter actinomycetemcomitans Serotipe-C UNAIR, Indonesia - Media Triptic Soy Agar Difco, USA - NaCl 0,9 1 liter Kimia Farma, Indonesia 3.6.2 Alat Penelitian - Lemari pengering - Kertas perkamen - Vaccum Rotary Evaporator Heidolph VV 2000, Germany - Perkolator - Kapas Bio Panca, Indonesia - Alumunium foil 1 gulungan - Erlenmeyer Pyrex, USA Universitas Sumatera Utara - Destilator - Lemari penyimpan petri - Piring petri Pyrex, Japan - Blender Panasonic, Japan - Kertas saring Whatman no.42, England - Autoklaf Tomy, Japan - Inkubator CO 2 Sanyo, Japan - Electronic Balance Ohyo JP2 6000, Japan - Vortexwhirli mixer Iwaki model TM 100, Japan - Pipet mikro dan tips Gilson, France - Kaca pembesar Ootsuka ENV-CL, Japan - Ose - Spiritus 3.7 Proses Pengambilan dan Pengumpulan Data 3.7.1 Prosedur Pembuatan Ekstrak Kulit Jeruk Purut Buah yang dipakai adalah buah yang segar. Buah jeruk purut diperoleh dari Kelurahan Tegal Sari, Kecamatan Medan Denai. Bahan baku berupa buah jeruk purut sebanyak 2000 gram dibersihkan dari kotoran, dicuci bersih, ditimbang, dan dikupas kulitnya. Selanjutnya kulit jeruk purut diiris tipis-tipis dan dikeringkan di lemari pengering selama 10 hari. Universitas Sumatera Utara Gambar 6. Tanaman buah jeruk purut yang berasal dari Kelurahan Tegal Sari, Kecamatan Medan Denai Gambar 7. Jeruk purut dicuci dan dibersihkan dari kotoran Universitas Sumatera Utara a Gambar 8. Kulit jeruk purut a diiris tipis-tipis dan b dikeringkan dalam lemari pengering Sampel yang telah kering kemudian diblender sampai menjadi serbuk simplisia kemudian dimasukkan ke dalam wadah dan dimaserasi selama 3 jam dengan pelarut etanol 96. Diaduk sesekali dalam keadaan etanol cukup merendam sampel. Selanjutnya simplisia diperkolasi dengan menggunakan perkolator yang ditutup dengan aluminium foil dan dibiarkan selama 24 jam dengan keadaan etanol cukup merendam sampel. Bagian ujung alat perkolator disumbat dengan kapas basah dan dilapisi kertas saring. Gambar 9. Kulit jeruk purut yang sudah kering dihaluskan b Universitas Sumatera Utara Gambar 10. Simplisia dimaserasi dalam etanol 96 selama 3 jam Setelah 24 jam, bagian ujung perkolator yang disambungkan pada tabung untuk menampung cairan dapat dibuka dengan kecepatan tetesan ±20 tetes menit. Sampel pada tabung perkolator tetap dijaga dalam kondisi terendam dalam etanol selama dilakukan penampungan perkolat. Prosedur penampungan perkolat dilakukan sampai perkolat yang dihasilkan jernih. Gambar 11. Penampungan perkolat Semua perkolat digabung dan disaring, lalu diuapkan dengan menggunakan Vaccum Rotary Evaporator pada tekanan 1 ATM dengan temperatur ൑50˚C. Hasil akhir yang didapat adalah ekstrak kental kulit jeruk purut. Universitas Sumatera Utara Gambar 12. Penguapan perkolat dengan menggunakan Vaccum Rotary Evaporator

3.7.2 Pengenceran Bahan Coba

Ekstrak kulit jeruk purut ditimbang menggunakan Electronic balance dan massanya disesuaikan dengan konsentrasi yang diinginkan dengan cara dilarutkan dengan media Triptic Soy Broth TSB. Disediakan 5 buah tabung, pada tabung pertama diisi 2 ml ekstrak kulit jeruk purut sehingga diperoleh ekstrak kulit jeruk purut dengan konsentrasi 100. Empat buah tabung yang lainnya kemudian diisi masing-masing 1 ml TSB. Selanjutnya dilakukan pengenceran dengan cara mengambil setengah dari ekstrak kulit jeruk purut konsentrasi 100 menggunakan mikropipet dan diletakkan pada tabung ke-2 untuk mendapatkan ekstrak kulit jeruk purut 50 pengenceran ganda. Demikian seterusnya sampai didapatkan konsentrasi 25, 12,5 dan 6,25. Tabung-tabung tersebut kemudian diberi label sesuai konsentrasinya.

3.7.3 Pembuatan Media Bakteri

Proses pembiakan spesimen dilakukan setelah pembuatan media TSA. Sebanyak 20 gram TSA dilarutkan ke dalam 500 ml aquadest untuk 40 petri 20 mlpetri. Media disterilkan di dalam autoklaf selama 15-20 menit dengan tekanan udara 2 ATM, suhu 121˚C. Apabila telah disterilkan, media disimpan di dalam lemari Gambar 13. Ekstrak kental kulit jeruk purut Universitas Sumatera Utara pendingin. Jika akan digunakan kembali, media dipanaskan kembali hingga mendidih, lalu dituangkan ke dalam masing-masing petri dan dibiarkan hingga dingin. Gambar 14. Media dimasukkan ke dalam a autoklaf dan b dituangkan ke masing-masing petri

3.7.4 Pembiakan Spesimen

Kegiatan pembiakan spesimen dilakukan dalam suasana anaerob pada inkubator CO 2 . Aggregatibacter actinomycetemcomitans yang digunakan adalah spesimen Aggregatibacter actinomycetemcomitans yang telah dibiakkan secara murni pada media TSA yang telah dipersiapkan pada prosedur sebelumnya dalam suasana anaerob. Sebanyak 1-2 ose dari biakan murni bakteri uji yang telah dikultur dan tumbuh dengan subur disuspensikan dengan menggunakan larutan NaCl 0,9 sampai diperoleh kekeruhan sesuai standar Mac Farland atau sebanding dengan jumlah bakteri 1 x 10 8 CFUml. a b Universitas Sumatera Utara Gambar 15. Biakan murni Aggregatibacter actinomycetemcomitans

3.7.5 Penentuan KHM bahan coba

Bahan coba ekstrak kulit jeruk purut yang dipakai terdiri dari konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, 6,25. Masing-masing konsentrasi tersebut diambil sebanyak 1 ml lalu dimasukkan ke dalam mikro plate kemudian diberi label sesuai dengan konsentrasinya. Selanjutnya ambil 1 ml suspensi bakteri yang telah dipersiapkan sebelumnya dengan menggunakan mikropipet lalu dimasukkan ke dalam masing-masing mikro plate bahan coba yang telah diberi label kamudian divoteks. Lalu mikro plate tersebut diinkubasi pada suhu 37˚C selama 24 jam pada inkubator CO 2 dan diamati kekeruhan yang terjadi dengan membandingkan tabung- tabung tersebut dengan kontrol untuk menentukan nilai KHM dari masing-masing bahan coba. Tabung dengan kekeruhan yang mulai tampak jernih untuk setiap kelompok perlakuan merupakan KHM yaitu konsentrasi minimum ekstrak atau bahan uji apapun yang mampu menghambat pertumbuhan Aggregatibacter actinomycetemcomitans dalam media perbenihan setelah diinkubasi 24 jam dan tidak tumbuh koloni kuman dalam perbenihan tersebut. Universitas Sumatera Utara Gambar 16. Suspensi bakteri a dimasukkan ke bahan coba dan b diinkubasi selama 24 jam

3.7.6 Penentuan KBM bahan coba

Penelitian dilanjutkan dengan penentuan KBM bahan coba dengan menggunakan metode Drop Plate Mills Mesra. Bahan coba dengan konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, 6,25 masing- masing divoteks dan diambil 50 μl untuk tiap konsentrasi lalu diteteskan ke dalam media padat Triptic Soy Agar direplikasi 5 petri, diamkan selama 15-20 menit sampai mengering dan diinkubasi dalam inkubator CO 2 dengan suhu 37˚C selama 24 jam. Dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri dengan prinsip satu sel bakteri hidup bila dibiakkan pada media padat akan tumbuh menjadi 1 koloni bakteri. Perhitungannya adalah bila bentuk koloni melebar dianggap berasal dari 1 koloni, bila bentuknya 2 koloni bersinggungan dianggap sebagai 2 koloni. Satuan yang dipakai adalah CFU Colony Forming Unit ml cairan suspensi. Apabila telah dihitung jumlah koloni bakteri pada masing-masing tetesan, kemudian dibuat jumlah reratanya dan dikalikan dengan faktor pengenceran dan faktor pengali. Oleh karena konsentrasi yang akan dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri merupakan konsentrasi awal sebelum dilakukan dilusi maka faktor pengenceran x 1, selain itu karena pada penetesan suspensi bahan coba dan bakteri pada media padat sebanyak 50 μl, maka hasil perhitungan harus dikali dengan faktor pengali 20 untuk mendapatkan hasil sesuai satuan standar CFUml. a b Universitas Sumatera Utara Gambar 17. Metode Drop Plate Mills Mesra

3.8 Skema Alur Penelitian

Pembuatan Ekstrak Kulit Jeruk Purut Pembuatan Media Bakteri Pembiakan Spesimen Penentuan KHM Bahan Coba Penentuan KBM Bahan Coba Analisis Data Pengenceran Bahan Coba Universitas Sumatera Utara

3.9 Analisis Data

Data hasil pengujian antibakteri dianalisis dengan memakai uji statistik sebagai berikut: - Uji analisis varian satu arah ANOVA, untuk melihat perbedaan efek antibakteri ekstrak etanol kulit jeruk purut terhadap pertumbuhan bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Universitas Sumatera Utara

BAB 4 HASIL PENELITIAN

4.1 Ekstraksi Kulit Jeruk Purut

Ekstrak kulit keruk purut yang diperoleh berasal dari 2000 gram buah jeruk purut yang kemudian dihaluskan menjadi bentuk simplisia sehingga didapatkan 250 gram simplisia. Simplisia tersebut kemudian diperkolasi dengan menggunakan pelarut etanol 96 dan didapat maserat cair sebanyak 4 liter dari proses tersebut. Kemudian maserat cair diuapkan dalam alat vacuum rotary evaporator sehinggga diperoleh ekstrak kental berwarna kecoklatan sebanyak 70 gram. Ekstrak kental dimasukkan ke dalam wadah tertutup dan disimpan dalam lemari pendingin. Gambar 18. Ekstrak kental kulit jeruk purut

4.2 Uji Efektivitas Antibakteri

Pengujian daya antibakteri dilakukan dengan mengamati perubahan kekeruhan pada tiap konsentrasi bahan coba 100, 50, 25, 12,5, dan 6,25. Penetapan konsentrasi berdasarkan pada standard Laboratorium Tropical Disease, UNAIR dengan metode pengenceran ganda dilusi. Universitas Sumatera Utara