14
3.8 Persiapan media uji
Peremajaan kultur murni dilakukan dengan cara bakteri uji E. coli dan S. aureus diambil masing-masing 1 ose dari media agar yang tersedia secara aseptik,
kemudian diinokulasikan dengan cara digoreskan pada medium nutrien Agar NA miring selanjutnya diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam. Pembuatan suspensi mikroba uji dilakukan dengan cara mengambil
sebanyak 1 ose bakteri dari media agar yang tersedia secara aseptik, lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi NaCl 0,9, yaitu sebagai
larutan blanko. Setelah itu optical density-nya OD diukur dengan spektrofotometer dengan panjang gelombang 600 nm hingga didapatkan
kepadatan 0,1. Pada OD seperti ini konsentrasi bakteri setara dengan 108 selml Brock dan Madigan 1991 dalam Nabaing 2006, sedangkan pembuatan larutan
ampicilin trihidrat 30 ppm dilakukan dengan cara larutan antibiotik ampicilin 3 mg dilarutkan dengan air suling steril sedikit demi sedikit kemudian dicukupkan
volumenya hingga 100 ml di dalam labu takar.
3.5. Uji daya hambat antibakteri
Untuk uji daya hambat antibakteri digunakan bakteri patogen S. aureus dan E.coli sebagai bioindikatornya. Metode yang digunakan adalah metode difusi
agar yang digunakan untuk uji bioindikator. Sampel ekstrak karang lunak dan pelarutnya dilakukan perbandingan 1:3
dengan konsentrasi sampel karang lunak yang digunakan pada paper disc yaitu ,48 gram ekstrak karang lunak dalam 180 μl pelarutnya dengan ukuran sampel
yang dimasukkan dalam tiap paper disc sebesar 30 μl. Biakan bakteri sebanyak 1 dari volume media agar dicampurkan
dengan media TSA yang masih cair dan diaduk rata. Sebanyak 15-20 ml media agar yang mengandung bakteri dituang ke cawan petri steril, kemudian ditutup
dan dibiarkan membeku. Paper disc yang telah ada diberi ekstrak dan diletakkan di atas kultur bakteri dalam agar dan ditutup. Perlakuan kontrol kontrol positif:
Ampicilin trihidrat, dan kontrol negatif; DMSO dikerjakan seperti perlakuan sampel. Kultur diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37
o
C dan RH 90 selama 24 jam atau 1 hari. Pengamatan dilakukan terhadap ukuran zona bening yang
terbentuk di sekitar cakram kertas saring dengan menggunakan kaliper Grunenthal 1998.
3.6. Uji Fitokimia Harborne 1987
Identifikasi kandungan senyawa bioaktif dari sampel karang lunak dalam penelitian ini dilakukan dengan pengujian sebagai berikut :
Uji Alkaloid
Sebanyak 1 gram ekstrak dilarutkan dengan 5 ml kloroform dan kemudian disaring ke dalam tabung reaksi tertutup. Ekstrak kloroform dalam tabung dikocok
dengan menambahkan 10 tetes H
2
SO
4
, kemudian lapisan asamnya dipindahkan kedalam tabung reaksi yang lain. Lapisan asam ini diteteskan pada plat tetes dan
ditambahkan pereaksi Mayer, Wagner dan Dragendorf yang akan menimbulkan endapan berturut-turut berwarna putih, cokelat dan merah jingga.
15
Pereaksi Meyer dibuat dengan cara menambahkan 1.36 gram HgCl
2
dengan 0.5 gram kalium iodida lalu dilarutkan dan diencerkan dengan akuades menjadi 100 ml dengan labu takar. Dimana pereaksi tidak berwarna.
Pereaksi Wagner dibuat dengan cara 10 ml akuades dipipet kemudian 2.5 gram iodin dan 2 gram kalium iodida lalu dilarutkan dan diencerkan dengan
akuades menjadi 200 ml dalam labu takar. Pereaksi ini berwarna coklat. Pereaksi Dragendroff dibuat dengan cara 0.8 bimut subnitrat ditambahkan
10 ml asam asetat dan 40 ml air. Larutan ini dicampur dengan larutan yang dibuat dari 8 gram kalium iodida dalam 20 ml air. Sebelum digunakan, 1 volume
campuran ini diencerkan dengan 2.3 volume campuran 20 ml asam asetat glacial dan 100 ml air. Pereaksi berwarna jingga.
Uji Flavonoid
Sebanyak 1 gram ekstrak ditambahkan 100 ml air panas kemudian didihkan selama 5 menit dan disaring. Filtrat yang diperoleh kemudian diambil
sebanyak 10 ml, ditambahkan dengan serbuk Mg 0,5 gr, 1 ml HCl dan 1 ml amil alkohol. Campuran dikocok kuat. Uji positif ditandai dengan munculnya warna
merah, kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol.
Uji Triterpenoid dan Steroid
Uji ini menggunakan pereaksi Lieberman-Buchard. Pada pengujian ini, sebanyak 2 gram ekstrak dimeserasi dengan 25 ml Etanol panas selama 1 jam
kemudian disaring dan residu ditambahkan eter. Filternya ditambah dengan 3 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat secara berurutan. Larutan
dikocok perlahan dan dibiarkan beberapa menit. Uji positif ditandai dengan warna merah atau ungu untuk triterpenoid sertaa hijau atau biru untuk steroid.
Uji Saponin
Sejumlah sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Lalu tambahkan air panas kedalam sampel. Amati perubahan yang terjadi dengan terbentuknya busa.
Reaksi positif jika busa stabil selama 30 menit dan tidak hilang pada penambahan 1 tetes HCl
2
N.
Uji Fenol Hidrokuinon
Sampel sebanyak 0,5 gr diekstrak dengan 10 ml etanol 70. Larutan yang dihasilkan diambil sebanyak 1 ml. Lalu 2 tetes Larutan FeCl
3
5 ditambahkan. Amati perubahan yang terjadi, terbentuknya warna hijau atau hijau biru
menunjukkan adanya senyawa fenol dalam bahan. Uji Tanin
Sebanyak 1 gr ekstrak ditambahkan kedalam 100 ml air panas kemudian dididihkan selama 5 menit lalu disaring. Sebanyak 10 ml filtrat ditambah 10 ml
FeCl
3
1. Uji positif ditandai dengan munculnya warna hijau kehitaman.