54 Tabel 9. Nilai total nitrogen pada substrat dengan pH yang berbeda
Substrat Total Nitrogen
pH 3 11
pH 4 13
pH 5 20
Otoklaf pH 5 19
Pada Tabel 9, semakin tinggi pH, maka semakin tinggi kadar nitrogen yang terbentuk. Hal ini disebabkan karena untuk menaikkan pH yang lebih tinggi diperlukan penambahan amoniak yang lebih
banyak. Penambahan amoniak yang lebih banyak menyebabkan nitrogen yang terbentuk menjadi lebih banyak. Substrat dari perlakuan otoklaf sebagai pembanding perlakuan gelombang mikro dibuat pada
kondisi pH 5 sehingga jumlah total nitrogen yang terukur hampir sama dengan jumlah total nitrogen pada substrat pH 5.
4.3.1 Volume Pembentukan CO
2
Pengamatan terhadap peningkatan volume CO
2
dilakukan pada lima substrat yang berbeda yaitu substrat dari perlakuan gelombang mikro dua tahap terbaik pH 3, 4, 5, glukosa teknis dan
perlakuan otoklaf. Volume CO
2
yang terbentuk selama fermentasi dari berbagai substrat diperlihatkan pada Lampiran 4, sedangkan pola akumulasi CO
2
diperlihatkan pada Gambar 10.
Gambar 10. Akumulasi pertambahan volume CO
2
pada fermentasi substrat yang berbeda selama 72 jam oleh Issatchenkia orientalis
Pengamatan terhadap pertambahan CO
2
digunakan sebagai data pendukung bahwa khamir yang digunakan mampu menghasilkan CO
2
sebagai produk samping dari fermentasi, sedangkan etanol sebagai produk utama dianalisa menggunakan Gas Chromatography GC yang datanya disajikan
pada Tabel 11. Hasil pengamatan terhadap proses fermentasi menunjukkan bahwa khamir dengan berbagai perlakuan substrat pH 3-5, mampu menghasilkan CO
2
dan diduga hasil tersebut sebanding dengan etanol yang dihasilkan karena sistem fermentasi disusun agar reaksi berlangsung secara
anaerobik. Seiring dengan lamanya waktu fermentasi, terjadi peningkatan volume CO
2
yang dihasilkan hingga pada waktu tertentu peningkatan tersebut tidak terlalu signifikan. Hal ini dapat
diartikan bahwa I. orientalis mampu mengkonversi gula dari substrat hasil hidrolisis secara asam
10 20
30 40
50 60
70
3 6
9 12
18 24
30 36
42 48
60 72
V o
lu me
C O
2
ml
Lama fermentasi jam
pH 3 pH 4
pH 5 Otoklaf
Glukosa Teknis
55 perlakuan gelombang mikro dua tahap menjadi etanol dan ketika substrat mulai habis terjadi
penurunan laju pembentukan etanol. Pada Gambar 10 terlihat bahwa volume CO
2
tertinggi yang dihasilkan dari fermentasi substrat yang berbeda oleh I. orientalis adalah pada substrat pH 5. Dengan demikian, laju fermentasi pada
substrat pH 5 lebih tinggi dibandingkan laju fermentasi menggunakan substrat pH 3 dan 4. Hal ini diduga karena I. orientalis memiliki viabilitas yang lebih tinggi pada kondisi lingkungan pertumbuhan
yang tidak terlalu asam, selain itu pada substrat pH 5, sumber nitrogen N yang berfungsi sebagai pembentukan sel lebih banyak jumlahnya dibandingkan substrat pada pH yang lebih rendah. Dengan
demikian, fermentasi dari substrat terbaik pada penelitian ini adalah pada pH 5 jika diukur dengan pendekatan pembentukan CO
2
. Pengukuran volume CO
2
pada proses fermentasi merupakan pendekatan pengukuran kadar etanol secara tidak langsung. Bonciu et al. 2010 juga melakukan pengamatan terhadap perubahan
volume CO
2
yang dihasilkan dalam proses fermentasi. Perubahan CO
2
tersebut secara tidak langsung digunakan untuk menentukan kadar bioetanol yang dihasilkan oleh isolat khamir dari hidrolisat inulin.
Kadar bioetanol ditentukan dari volume CO
2
dikalikan dengan koefisien 1.045 hasil persamaan Gay- Lussac.
Pada awal fermentasi, khamir memerlukan oksigen untuk pertumbuhan, tetapi setelah terjadi akumulasi CO
2
, reaksi berubah menjadi anaerobik. Pada kondisi anaerobik, khamir memetabolisme glukosa menjadi etanol sebagian besar melalui jalur Embden Meyerhof Parnas EMP. Setiap mol
glukosa terfermentasi menghasilkan dua mol etanol, CO
2
dan ATP. Oleh karena itu, secara teoritis setiap g glukosa menghasilkan 0.51 g etanol. Pada kenyataannya, etanol yang dihasilkan biasanya
tidak melebihi 90-95 dari hasil teoritis karena sebagian nutrisi digunakan untuk sintesa biomassa dan memelihara reaksi. Reaksi samping juga dapat terjadi dan menghasilkan gliserol dan suksinat
yang dapat mengkonsumsi 4-5 substrat Oura 1983. Etanol yang dihasilkan dapat menghalangi fermentasi lebih lanjut saat konsentrasinya mencapai 13-15 volume, tetapi hal ini dipengaruhi oleh
suhu dan jenis khamir Prescott dan Dunn 1981 dalam Dwi Ko 2010.
4.3.2 Pembentukan Asam dan Penurunan pH
