3.5.14 Disfungsi seksual: Kondisi dimana tidak mampu melakukan penetrasi dan koitus karena gangguan ereksi penis.
3.5.15 Analisa Semen: analisis sperma rutin yang terdiri dari volume cairan semen, densitas, motilitas A progresif, motilitas A + B total, bentuk
normal. Menurut kriteria WHO, parameter cairan semen yang normal adalah:
Volume: 1,4-1,7 ml Kepadatan: 12-16000000 ml
Motilitas A progresif: 31 - 34 Motilitas A + B total: 38 - 42
Bentuk normal: 3 - 4 WHO, 2010
3.6 Metode dan Prosedur Laboratorium
3.6.1 Pengambilan sampel 3.6.1.1 Pengumpulan data
Pengumpulan data dilakukan dengan menggunakan kuesioner, yang dirancang untuk memperoleh informasi mengenai data karakteristik dan
demografis usia, BMI, agama, pekerjaan, pendidikan, status perkawinan, status kesuburan lama perkawinan, jumlah anak, riwayat keguguran, Status
seksual kebiasaan seksual, riwayat penyakit menular seksual, infeksi urogenitalia, dan status kesehatan riwayat penyakit, riwayat operasi, riwayat
pemakaian obat, riwayat radiasi. Temuan diagnostik fisik termasuk tanda- tanda vital, umum dan status lokalisata dengan status genitalia juga
dimasukkan dalam kuesioner 3.6.1.2 Metode pengumpulan semen dan prosedur laboratorium untuk
pemeriksaan fragmentasi DNA sperma Semen analisis dan fragmentasi DNA sperma dilakukan di Laboratorium
IVF HFC, Divisi Endokrinologi Reproduksi dan Infertilitas, Departemen Ostetri Ginekologi, Fakultas Kedokteran, USU, Rumah Sakit H. Adam Malik,
Medan. Para peserta penelitian diminta untuk memproduksi sperma untuk analisis
semen dan indeks fragmentasi DNA sperma dalam keadaan sebagai berikut: 1. Pasien dipantangkan berhubungan seksual selama 2-5 hari.
2. Sperma dikumpulkan dalam wadah steril.
Universitas Sumatera Utara
3. Sperma diproduksi dengan masturbasi. 4. Sperma harus dianalisa dalam waktu 2 jam setelah diproduksi.
5. Analisis sperma rutin juga sedang dilakukan.
Teknik pengujian fragmentasi DNA sperma dengan menggunakan kit Halosperm:
a. Tahap memasukkan sampel di-gel agarosa mikro. • Pertahankan suhu larutan lisis botol C pada suhu kamar 22 ° C.
• Encerkan sampel cairan semen dalam medium kultur atau PBS dengan konsentrasi 5-10 juta per mililiter. Baik sampel segar ataupun beku
langsung dari nitrogen cair dapat digunakan. • Masukkan tabung A mengapung di air dengan batas harus setinggi batas
atas tabung, dan biarkan mengapung di air 5 menit pada suhu 90 - 100 ° C, sampai agarosa mencair. Atau, agarosa dapat dicairkan dalam
microwave. • Transfer tabung A, dengan kondisi mengapung ke dalam water bath
dipertahankan pada suhu 37 ° C dan biarkan selama 5 menit . • Tambahkan 60 mikro-liter sampel cairan semen ke dalam tabung A dan
campurkan
• Tempatkan slide pada permukaan yang dingin suhu 4 ° C misalnya, pelat logam atau kaca.
• Setelah slide didinginkan, taruhlah suspensi sel dari tabung A ke slide permukaan yang ditandai dengan titik merah dan tutup cover glass kaca,
berhati-hati untuk menghindari gelembung udara. Tetesan dengan ukuran 14, 20 atau 59 mikro-liter dianjurkan memakai cover glass sesuai urutan
ukuran 18x18mm 24x60mm 22x22mm. Disarankan bahwa slide disimpan dalam posisi horizontal selama seluruh proses.
• Masukkan pelat dingin dengan slide ke dalam kulkas dan tinggalkan sampel menjadi gel selama 5 menit.
b. Pengolahan sperma.
• Siapkan solusi denaturasi. Untuk melakukan hal ini, tambahkan 80 liter mikro-liter dari tabung B dengan 10 mililiter air destillasi, campurkan dan
tempatkan di baki inkubasi.
Universitas Sumatera Utara
• Lepaskan penutup kaca dengan menggeser secara lembut dan segera masukkan slide ke dalam larutan denaturasi dalam posisi horizontal, dan
tinggalkan untuk inkubasi selama 7 menit pada suhu kamar 22 ° C. • Dengan memakai sarung tangan, mengambil slide dengan bantuan
sebuah lanset. Tahan secara horizontal dan tempatkan tetap horizontal, pada nampan inkubasi lain yang berisi 10 ml larutan lisis tabung C yang
dipanaskan. Inkubasi selama 25 menit. • Ambil slide dan letakkan secara horizontal ke dalam nampan yang berisi
air suling yang berlimpah dalam rangka untuk mencuci larutan lisis. Tinggalkan untuk inkubasi selama 5 menit.
• Masukkan slide horizontal ke dalam nampan yang berisi etanol 70 2 menit, diikuti dengan etanol 90 2 menit dan akhirnya, etanol 100 2
menit. • Biarkan kering secara alami, setelah dikeringkan, slide diproses dapat
disimpan dalam kotak arsip pada suhu kamar, selama berbulan-bulan. c. Pewarnaan sampel.
Pewarnaan dilakukan ketika slide harus divisualisasikan dan dianalisis dengan observasi melalui mikroskop lapangan terang.
• Campur larutan pewarnaan Wright dengan larutan buffer Phospate 1:1 vol vol dan endapkan sebagai satu lapisan secara horizontal untuk
menutupi mikro- gel kering. • Biarkan pewarnaan berlangsung selama 4 - 10 menit, tiup sesekali. Cuci
pewarnaan yang berlebihan dan cuci di bawah air mengalir dengan lembut
dan biarkan kering. • Jika slide diwarnai berlebihan, maka warna mungkin sebagian dapat di
lunturkan dengan mencuci di air yang mengalir berlimpah. • Hal ini juga mungkin dapat dilakukan untuk menghapus pewarnaan
dengan etanol, biarkan kering dan diwarnai lagi. • Dalam hal pewarnaan terlalu lemah, khususnya di wilayah lingkaran halo
dispersi kromatin, memungkinkan untuk kembali diwarnai dengan menggunakan larutan pewarnaan Wright.
• Jika preparat permanen diharapkan, ini dapat menggunakan Eukitt. d. Visualisasi mikroskopik dan klasifikasi inti.
d.1. Analisis visual langsung
Universitas Sumatera Utara
Nucleoid, yang berhubungan dengan inti spermatozoa yang mengalami deproteinisasi massif, yang terdiri dari dua bagian: inti spermatozoa
silhoutte, yang disebut sebagai inti, diposisikan di tengah, dan halo perifer dari kromatin DNA dispersi. Ekor spermatozoa dapat terlihat.
Awalnya, studi minimal 500 spermatozoa per sampel dianjurkan untuk selanjutnya 200 spermatozoa sudah mencukupi, mengadopsi kriteria
berikut:
Gambar 5. Halosperm Direproduksi dari Teknologi Konsepsi, 2007
Gambar 6. Normal Sperma yang berfragmentasi Direproduksi dari Teknologi Konsepsi, 2007
Spermatozoa tanpa fragmentasi DNA • Spermatozoa dengan halo besar: Spermatozoa dimana ketebalan halo sama
dengan, atau lebih besar dari ukuran diameter terkecil dari inti Gambar1. • Spermatozoa dengan halo ukuran menengah : Ketebalan halo berada
antara: lebih besar dari 1 3 diameter terkecil dari inti dan kurang dari diameter terkecil inti Gambar 2.
normal
fragmented abnormal
Figure 1 Figure 2
Figure 3 Figure 4
Figure 5
Universitas Sumatera Utara
Spermatozoa dengan DNA fragmentasi • Spermatozoa dengan halo kecil: Ketebalan halo sama dengan atau lebih
kecil dari 1 3 diameter terkecil dari inti. Ini mungkin memiliki bentuk tidak teratur atau bisa dibilang hampir tak terlihat Gambar 3.
• Spermatozoa tanpa halo Gambar 4. • Spermatozoa tanpa halo dan dengan tanda-tanda kerusakan: Mereka yang
tidak menunjukkan tanda-tanda halo dan menyajikan inti terpecah menjadi butiran atau menunjukkan pewarnaan sangat lemah Gambar 5.
• Lainnya: inti sel yang tidak mirip dengan spermatozoa. Salah satu karakteristik morfologi yang membedakan mereka adalah tidak adanya ekor.
Gambar 7. Pandangan umum lapangan dengan berbagai jenis spermatozoa Direproduksi dari Teknologi Konsepsi, 2007
d.2 Slide dibaca oleh dua personel dan hasil dari keduanya dijumlahkan dan kemudian dibagi dua untuk menghindari bias interobserver.
N
N f
f
N
f N
N f
f N
f N
N
Universitas Sumatera Utara
3.6.1.3 Metode pemeriksaan dan prosedur laboratorium pemeriksaan kadar plasma seminalis homosistein
Semen sampel untuk pengujian homosistein cairan semen dikirim ke Laboratorium Prodia.
Metode pengolahan dan prosedur laboratorium sebagai berikut: a. Sampel semen yang terlikuedasi akan disentrifugasi pada
3000rpm selama 5 menit, plasma seminalis supernatan kemudian dengan hati-hati diambil dan dipindahkan ke tabung
Eppendorf. b. Usahakan tabung tegak setiap saat.
c. Bekukan sampel hanya sekali dan dicampur menyeluruh setelah pencairan.
d. Jangan simpan pada suhu kamar. e. Tutup erat tutupan tabung dan masukkan ke kulkas spesimen
pada suhu 2 sampai 8 °C sampai pengujian. f. Bekukan sampel pada atau di bawah -20 °C jika sampel tidak
diuji dalam waktu 48 jam. Sampel dapat disimpan pada atau di bawah -20°C sampai 13 minggu.
g. Sebelum menempatkan sampel pada sistem ,pastikan bahwa sampel bebas dari partikulat dan gelembung.
h. Uji Centaur ADVIA HCY membutuhkan 20μL sampel untuk
penentuan sekali . i. Taruhlah Sampel pada sistem dan secara otomatis akan
berjalan sebagai berikut: -
campurkan 50μL agen reduksi dan inkubasi selama 3 menit pada 37°C.
- Campurkan 50μL reagen enzim dan inkubasi selama 2,5 menit
pada 37°C. -
Campurkan 250μL fase padat dan inkubasi selama 2,5 menit pada 37°C.
- Campurkan 100μL reagen lite dan inkubasi selama 2,5 menit pada
37°C. - Pisahkan, aspirasi dan cuci cuvettes dengan reagen air .
Universitas Sumatera Utara
- Campurkan masing- masing 300μL reagen asam dan basa untuk
memulai reaksi chemiluminescent. - Laporan hasil berdasarkan opsi yang dipilih seperti yang
dijelaskan dalam instruksi sistem operasi atau dalam sistem bantuan online.
j. Sistem akan melaporkan dalam ukuran umol L 3.6.1.4 Metode dan prosedur laboratorium pemeriksaan kadar plasma
homosistein paternal Sampel darah dikirim ke Laboratorium Prodia untuk tes homosistein
serum.
Metode pengumpulan darah dan pengujian sebagai berikut: a. Kumpulkan semua sampel darah dengan memperhatikan pencegahan
universal untuk venipuncture. b. Biarkan sampel serum untuk membeku secara memadai sebelum
sentrifugasi c. Tutup tabung dan tegakkan tabung setiap saat.
d. Bekukan sampel hanya sekali dan dicampur menyeluruh setelah pencairan.
e. Jangan simpan pada suhu kamar. f. Tutup erat tutupan tabung dan masukkan ke kulkas spesimen pada
suhu 2 sampai 8 ° C sampai pengujian. g. Bekukan sampel pada atau di bawah -20 ° C jika sampel tidak diuji
dalam waktu 48 jam. Sampel dapat disimpan pada atau di bawah -20 ° C sampai 13 minggu.
h. Sebelum menempatkan sampel pada system ,pastikan bahwa sampel bebas dari partikulat dan gelembung.
i. Uji Centaur ADVIA HCY membutuhkan 20μL sampel untuk penentuan
sekali .
j. Taruhlah Sampel pada sistem dan secara otomatis akan berjalan sebagai berikut
- campurkan 50μL agen reduksi dan inkubasi selama 3 menit pada
37°C. -
Campurkan 50μL reagen enzim dan inkubasi selama 2,5 menit pada 37°C.
Universitas Sumatera Utara
- Campurkan 250μL fase padat dan inkubasi selama 2,5 menit pada
37°C. -
Campurkan 100μL reagen lite dan inkubasi selama 2,5 menit pada 37°C.
- Pisahkan, aspirasi dan cuci cuvettes dengan reagen air . - Campurkan masing-
masing 300μL reagen asam dan basa untuk memulai reaksi chemiluminescent.
- Laporan hasil berdasarkan opsi yang dipilih seperti yang dijelaskan dalam instruksi sistem operasi atau dalam sistem bantuan online.
k. Sistem akan melaporkan dalam ukuran umol L
3.7 Analisis Data
