Jenis dan Rancangan Penelitian Tata Cara Analisis Hasil

25

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental murni dimana dilakukan perlakuan terhadap sejumlah variabel penelitian. Rancangan penelitian ini termasuk rancangan acak lengkap pola searah.

B. Variabel Penelitian

1. Variabel penelitian

a. Variabel bebas Variasi dosis pemberian ekstrak etanol daun M. tanarius jangka waktu tertentu pada tikus jantan terinduksi karbontetraklorida. b. Variabel tergantung Efek hepatoprotektif jangka pendek ekstrak etanol daun M. tanarius terhadap sel hati tikus yang terinduksi karbontetraklorida, dengan tolak ukur kuantitatif berdasarkan penurunan aktivitas serum ALT dan AST. c. Variabel pengacau terkendali Variabel pengacau yang harus dikendalikan yaitu: hewan uji tikus jantan galur Wistar, umur 2-3 bulan, berat badan 150-250 gram, jenis makanan dan pemberian secara oral. 26 d. Variabel pengacau tidak terkendali Variabel pengacau yang tidak dapat dikendalikan adalah kondisi patologis tikus.

2. Definisi operasional

a. Ekstrak daun M. tanarius adalah ekstrak kental yang diperoleh dengan mengekstraksi serbuk kering daun M. tanarius seberat 10,0 gram yang dilarutkan dalam 100 ml pelarut etanol 50 secara maserasi selama 72 jam, dengan putaran 140 rpm. Kemudian disaring dengan kertas saring dan diuapkan di oven selama 72 jam pada suhu 50 C, hingga bobot pengeringan tetap dengan susut pengeringan sebesar 0. b. Efek hepatoprotektif ekstrak etanol adalah kemampuan ekstrak etanol daun M. tanarius. Dosis tertentu melindungi hati dari hepatotoksin. c. Jangka waktu 6 jam, yaitu penelitian ini dilakukan dalam selang waktu 6 jam, hasil ini diperoleh sebagai waktu efektif dari penelitian efek hepatoprotektif ekstrak etanol jangka pendek pada tikus jantan terinduksi karbon tetraklorida.

C. Bahan Penelitian

1. Bahan utama

a. Bahan uji yang digunakan, yaitu daun M. tanarius yang dipanen dari Kebun Obat Fakultas Farmasi USD Yogyakarta pada bulan Mei 2012. 27 b. Subyek uji yang digunakan yaitu tikus jantan putih galur Wistar usia 2-3 bulan, berat badan 150-250 gram yang diperoleh dari Laboratorium Imono Fakultas Farmasi USD Yogyakarta.

2. Bahan kimia

a. Bahan hepatotoksin yang digunakan adalah karbontetraklorida, yang diperoleh dari Laboratorium Kimia Analisis Fakultas Farmasi USD Yogyakarta. b. Kontrol negatif berupa olive oil yang diperoleh dari Laboratorium Farmakologi-Toksikologi Fakultas Farmasi USD Yogyakarta. c. Pelarut untuk maserasi berupa etanol-air yang diperoleh dari Laboratorium Farmakologi-Toksikologi Fakultas Farmasi USD Yogyakarta. d. Pelarut untuk hepatotoksin karbontetraklorida berupa olive oil yang diperoleh dari Laboratorium Farmakologi-Toksikologi Fakultas Farmasi USD Yogyakarta. e. Aquabidest yang dipergunakan dalam uji serum darah yang diperoleh dari Laboratorium Farmakologi-Toksikologi Fakultas Farmasi USD. f. Bahan untuk mengukur aktivitas serum ALT dan AST berupa reagen kit- ALT GPT FS dan kit-ASAT GOT FS produksi Dyasis yang digunakan untuk mengukur aktivitas ALT-AST serum. Masing- masing bahan terdiri atas dua reagen, yaitu Reagen 1 dan Reagen 2. 28 Kit-ALAT GPT FS : R1 TRIS pH 7.15 140 mmolL L-Alanine 700 mmolL LDH Lactate dehydrogenase ≥ 2300 UL R2 2-Oxoglutarate 85 mmolL NADH 1 mmolL Pyridoxal-5-phosphate FS : Good’s buffer pH 9.6 100 mmolL Pyridoxal-5-phosphate 13 mmolL Kit-ASAT GOT FS : R1 TRIS pH 7.65 110 mmolL L-Aspartate 320 mmolL MDH Malate dehydrogenase ≥ 800 UL LDH Lactate dehydrogenase ≥ 1200 UL R2 2-Oxoglutarate 65 mmolL NADH 1 mmolL Pyridoxal-5-phosphate FS : Good’s buffer pH 9.6 100 mmolL Pyridoxal-5-phosphate 13 mmolL 29

D. Alat Penelitian

1. Alat pembuatan ekstrak etanol-air daun M. tanarius

Seperangkat alat gelas, yaitu Bekker glass, gelas ukur, labu ukur, cawan porselen, pipet tetes, batang pengaduk, mesin penyerbuk, shaker, oven, dan timbangan analitik.

2. Alat uji hepatoprotektif

Seperangkat alat gelas, yaitu Bekker glass, labu ukur, batang pengaduk, gelas ukur, timbangan analitik Mettler PM 4600 Delta Range dan Mettler AE 200 , spuit injeksi per oral, mikropipet, pipa kapiler, evendrof, vitalab mikro version 1,0 user manual E.merck, Darmsadt, Germany, stopwatch, vortex Genie, Wilten, Holland, dan sentrifuge.

E. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi daun M. tanarius

Determinasi daun M. tanarius dilakukan dengan mencocokkan ciri- ciri tanaman M. tanarius pada buku acuan determinasi Koorders dan Valeton, 1918 dan disesuaikan dengan kunci determinasinya.

2. Pengumpulan bahan uji

Bahan uji yang digunakan adalah daun M. tanarius yang masih segar dan berwarna hijau, dipanen dari Kebun Obat Fakultas Farmasi USD Yogyakarta pada bulan Mei 2012. 30

3. Pembuatan serbuk daun M. tanarius

Daun M. tanarius dicuci dengan air mengalir hingga bersih dan diangin-anginkan hingga kering. Pengoptimalan pengeringan dilakukan dengan oven pada suhu 50 C selama 72 jam. Daun yang telah kering diserbuk dengan alat penyerbuk. Setelah didapatkan serbuk kasar daun, kemudian dilakukan pengayakan dengan ayakan no. mesh 40 untuk mendapatkan serbuk daun M. tanarius yang lebih halus. 4. Pembuatan ekstrak etanol daun M. tanarius Sebelum pembuatan ekstrak, daun M. tanarius dibuat serbuk terlebih dahulu supaya kandungan fitokimia yang terkandung dalam daun M. tanarius lebih mudah terekstrak karena luas permukaan serbuk yang kontak dengan pelarut makin besar. Sebanyak 10 g serbuk kering daun M. tanarius diekstraksi secara maserasi dengan melarutkan serbuk dalam 100 ml pelarut etanol 50 pada suhu kamar selama 3x24 jam dengan kecepatan 140 rpm. Tujuan dilarutkan dalam pelarut etanol adalah agar senyawa kimia yang terkandung dalam daun M. tanarius dapat larut dalam pelarut. Setelah dilakukan perendaman, hasil maserasi disaring dengan kertas saring. Larutan hasil saringan dipindahkan dalam cawan porselen yang telah ditimbang sebelumnya, agar mempermudah perhitungan randemen ekstrak yang akan diperoleh. Selanjutnya, cawan porselen yang berisi larutan hasil maserasi tersebut dimasukkan dalam oven untuk diuapkan selama 72 jam dengan suhu 50°C agar mendapatkan ekstrak 31 etanol-air daun M. tanarius yang kental dengan bobot pengeringan ekstrak yang tetap yaitu sebesar 1,92 g Andini, 2010.

5. Penetapan konsentrasi pekat ekstrak

Menghitung rata-rata randemen ke-6 replikasi ekstrak metanol-air daun M. tanarius kental yang telah dibuat. Randemen ekstrak = Berat cawan ekstrak kental – berat cawan kosong ���� − ���� � = � � .1+� � .2+� � .3+� � .4+� � .5+� � .6 6 Konsentrasi ekstrak didapat dari hasil rata-rata randemen ekstrak. Konsentrasi yang dapat digunakan adalah konsentrasi pekat yang dapat dibuat dimana pada konsentrasi tersebut ekstrak dapat dimasukkan serta dikeluarkan dari spuit per oral. Cara pembuatannya adalah dengan melarutkan ekstrak percawannya, yaitu 1,92 g dalam labu ukur terkecil dengan pelarut yang sesuai, yaitu CMC Na 1. Labu ukur terkecil yang tersedia adalah labu ukur 5 ml sehingga konsentrasi ekstrak dapat ditetapkan, yaitu sebesar 0,384 gml atau 3840 mgml atau 38,4 bv Andini, 2010.

6. Penetapan dosis ekstrak metanol-air daun M. Tanarius

Dasar penetapan peringkat dosis adalah dari bobot tertinggi tikus dan pemberian cairan secara peroral separuhnya yaitu 2,5 ml. Penetapan dosis tertinggi ekstrak metanol-air daun M. tanarius adalah: D x BB = C x V D x 0,250 KgBB = 384 mgml x 2,5 ml D = 3840 mgKgBB 32 Dua dosis lainnya diperoleh dengan menurunkan 3 dan 6 kalinya dari dosis tertinggi sehingga didapatkan dosis 1280 mgKg BB dan 426 mgKg BB. Dosis yang akan digunakan dalam penelitian adalah 426 ; 1280 ; dan 3840 mgkg BB.

7. Pembuatan suspending agent CMC-Na 1

Suspending agent CMC-Na 1 dibuat dengan cara mendispersikan lebih kurang 1,0 g CMC-Na yang telah ditimbang seksama ke dalam air mendidih sampai volume 100,0 ml dan digunakan untuk membuat suspensi parasetamol.

8. Pembuatan larutan CCl4

Larutan CCl 4 dalam olive oil dibuat dengan cara melarutkan 1 bagian CCl 4 ke dalam 1 bagian olive oil sehingga didapatkan dosis 2 mlKg BB tikus.

9. Uji pendahuluan

a. Penetapan dosis hepatotoksin karbontetraklorida

Pemilihan dosis karbontetraklorida dilakukan untuk mengetahui pada dosis berapa karbontetraklorida mampu menyebabkan kerusakan pada hati tikus yang ditandai dengan peningkatan aktivitas GPT-serum paling tinggi. Dosis hepatotoksik yang digunakan dalam penelitian ini mengacu pada penelitian Janakat dan Al-Merie 2002, bahwa dosis 2 mlkg BB sudah terbukti mampu meningkatkan aktivitas ALT serum secara signifikan pada tikus bila diberikan secara intraperitonial tanpa menyebabkan kematian pada hewan uji. 33

b. Penetapan waktu pencuplikan darah

Menurut Janakat dan Al-Merie 2002, kenaikan serum ALT paling signifikan akan terjadi pada 24 jam setelah ingesti karbontetraklorida. Oleh karena itu akan dilakukan penetapan waktu pencuplikan darah tikus jantan dengan cara membagi tikus jantan dikelompokan dengan jumlah 5 ekor. Diambil darahnya pada jam ke 6 dengan berbagai variasi dosis. Serum darah diambil untuk diukur aktivitas serum ALT dan AST.

10. Pengelompokan dan perlakuan hewan uji

Hewan percobaan yang dibutuhkan sebanyak 30 ekor tikus jantan dibagi secara acak dalam 6 kelompok sama banyak. Kelompok I merupakan kontrol hepatotoksin karbontetraklorida dengan dosis 2 mlKg BB secara intra peritonial. Kelompok II merupakan kontrol negatif, yaitu pemberian olive oil secara intra peritonial. Kelompok III merupakan kontrol ekstrak etanolik daun M. tanarius. Kelompok IV-VI, diberikan ekstrak etanol daun M. tanarius dengan dosis 3840 ; 1280 ; dan 426 mgKg BB kemudian pada 6 jam setelah perlakuan diberikan dosis hepatotoksik karbon tetraklorida 2 mlKg BB. Pada jam ke-24 setelah ingesti karbontetraklorida, semua kelompok diambil darahnya pada daerah sinus orbitalis mata untuk penetapan aktivitas serum ALT dan AST.

11. Pembuatan serum

Darah mencit diambil melalui sinus orbitalis mata dengan pipa kapiler dan ditampung dalam tabung sentrifugasi melalui dinding tabung 34 kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit dan diambil supernatannya serum.

12. Pengukuran aktivitas serum ALT dan AST

Alat yang digunakan pada pengukuran aktivitas serum ALT dan AST adalah vitalab-mikro. Pada analisis fotometri ini dengan serum ALT dilakukan dengan reagen, yaitu reagen I dan reagen II. Reagen I berisi TRIS pH 7,65, L-Alanin, dan LDH laktat dehidrogenase. Reagen II berisi 2-oksoglutarat dan NADH. Analisis dilakukan dengan reaksi sebagai berikut: reagen I sebanyak 800 μL, dicampur dengan 200 μL reagen II, setelah itu dicampurkan serum sebanyak 100 μL dan dibaca resapan setelah tiga menit. Pada analisis fotometri dengan serum AST dilakukan reaksi sebagai berikut, yaitu reagen I dan reagen II. Reagen I berisi TRIS pH 7,65, L-Aspartat, LDH laktat dehidrogenase, dan MDH malat dehidrogenase. Reagen II berisi 2-oksoglutarat dan NADH. Analisis dilakukan dengan reaksi sebagai berikut: reagen I sebanyak 800 μL dicampur dengan 200 μL reagen II. Setelah itu dicampurkan serum sebanyak 100 μL dan dibaca resapan setelah tiga menit. Aktivitas enzim dilihat pada panjang gelombang 340 nm, suhu 37 o C, dan faktor koreksi 1745. Aktivitas serum ALT dan AST dinyatakan dalam UL. Pengukuran aktivitas serum ALT dan AST dilakukan di Laboratorium Anatomi-Fisiologi Manusia Fakultas Farmasi USD Yogyakarta. 35

F. Tata Cara Analisis Hasil

Data aktivitas serum ALT dan AST dianalisis dengan metode Kolmogoro Smirnov untuk melihat distribusi data tiap kelompok. Jika didapatkan distribusi data yang normal maka dilanjutkan dengan analisis pola searah One Way ANOVA dengan taraf kepercayaan 95 dan dilanjutkan dengan uji Scheffe untuk mengetahui perbedaan masing-masing kelompok. Akan tetapi bila didapatkan distribusi tidak normal, maka dilakukan analisis dengan uji Kruskal Wallis untuk mengetahui perbedaan aktivitas serum ALT dan AST antar kelompok. Setelah itu, dilanjutkan uji dengan Mann Whitney untuk melihat perbedaan tiap kelompok. Selain melakukan serangkaian uji statistik, dilakukan juga perhitungan efek hepatoprotektif dari ekstrak etanol daun M. tanarius. Rumus perhitungan efek hepatoprotektif : Aktivitas ALT− serum kontrol hepatotoksin karbon tetraklorida − Aktivitas ALT− serum perlakuan Aktivitas ALT− serum kontrol hepatotoksin karbon tetraklorida x 100 36

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui dan membuktikan khasiat dari ekstrak etanol-air daun M.tanarius sebagai agen hepatoprotektif pada tikus jantan terinduksi karbontetraklorida pada jangka waktu 6 jam. Untuk membuktikan hal tersebut, dilakukan serangkaian pengujian. Aktivitas ALT-AST serum menjadi tolak ukur kuantitatif dalam pengujian tersebut.

A. Hasil Determinasi Tanaman

Determinasi tanaman dilakukan bertujuan menetapkan kebenaran sampel yang digunakan berkaitan dengan ciri-ciri morfologis tanaman berdasarkan kepustakaan dan menghindari kesalahan dalam proses pengumpulan bahan. Bagian tanaman yang digunakan dalam determinasi adalah daun, batang, biji, bunga, dan buah. Dari hasil determinasi dinyatakn bahwa tanaman yang digunakan adalah benar M. tanarius.

B. Hasil Penimbangan Bobot Ekstrak Etanol-air daun M. tanarius

Pembuatan ekstrak etanol-air daun M. tanarius menggunakan metode maserasi. Pertimbangan menggunakan metode tersebut karena proses dan peralatan yang digunakan sederhana. Selain itu, metode maserasi digunakan untuk menyari simplisia yang mengandung zat aktif yang mudah larut dalam larutan penyari.