Pembuatan Ekstrak Etanol Kulit Buah Semangka Merah Berbiji Sterilisasi Alat Pembiakan Bakteri .1 Pembuatan stok kultur

29 menunjukkan adanya saponin Depkes RI., 1995.

3.6.6 Pemeriksaan antrakinon

Sebanyak 0,2 g serbuk simplisia ditambahkan 5 ml asam sulfat 2 N dipanaskan, setelah dingin ditambahkan 10 ml benzen, dikocok dan didiamkan. Lapisan benzen dipisahkan dan disaring. Lapisan benzen dikocok dengan 2 ml natrium hidroksida 2 N, didiamkan. Lapisan air berwarna merah dan lapisan benzen tidak berwarna menunjukkan adanya antrakinon Depkes RI., 1995.

3.6.7 Pemeriksaan steroidatriterpenoida

Sebanyak 1 g serbuk simplisia dimaserasi dengan 20 ml eter selama 2 jam, disaring, filtrat diuapkan dalam cawan penguap dan pada sisanya ditambahkan 20 tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes asam sulfat pekat pereaksi Lieberman- Burchard. Apabila terbentuk warna ungu atau merah yang berubah menjadi biru kehijauan menunjukkan adanya steroidatriterpenoida Harborne, 1987.

3.7 Pembuatan Ekstrak Etanol Kulit Buah Semangka Merah Berbiji

Pembuatan ekstrak dilakukan secara maserasi. Sebanyak 300 g serbuk simplisia dimasukkan kedalam sebuah bejana, dituangi 75 bagian etanol 96, ditutup, dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya sambil sering diaduk, kemudian diserkai dan diperas. Dicuci ampas dengan etanol 96 secukupnya hingga diperoleh 100 bagian. Dipindahkan ke dalam bejana bertutup, dibiarkan ditempat sejuk terlindung dari cahaya selama 2 hari. Dienap tuangkan atau disaring Ditjen POM RI, 1979. Maserat yang diperoleh dipekatkan dengan menggunakan rotary evaporatorpada temperatur ± 40°C sampai diperoleh ekstrak kental. Universitas Sumatera Utara 30

3.8 Sterilisasi Alat

Alat-alat yang digunakan dalam uji aktivitas antibakteri disterilkan terlebih dahulu sebelum dipakai. Alat-alat gelas yang mempunyai presisi dan media pertumbuhan bakteri disterilkan di autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit dan alat-alat gelas lainnya disterilkan didalam oven pada suhu 170 o C selama 1 jam. Jarum ose dan pinset disterilkan dengan menggunakan lampu bunsen Ditjen POM RI, 1995. 3.9 Pembuatan Media 3.9.1 Pembuatan media nutrient agar Komposisi: Lab-lemco powder 1,0 g Yeast extract 2,0 g Peptone 5,0 g Sodium chloride 5,0 g Agar 15 g Cara Pembuatan: Sebanyak 28 g media nutrient agar ditimbang dan dimasukkan kedalam erlenmeyer, kemudian ditambahkan air suling sebanyak 1000 ml, lalu dipanaskan sampai larut. Disterilkan di dalam otoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit Oxoid, 1982.

3.9.2 Pembuatan media nutrient broth

Komposisi: Lab lemco powder 1,0 g Yeast extract 2,0 g Peptone 5,0 g Sodium chloride 5,0 g Universitas Sumatera Utara 31 Cara Pembuatan: Sebanyak 13 g media nutrient broth yang sudah jadi ditimbang dan dilarutkan dengan air suling 1000 ml, lalu dipanaskan sampai larut sempurna. Media dimasukkan dalam erlenmeyer steril yang bertutup dan disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit Oxoid, 1982.

3.9.3 Pembuatan agar miring

Sebanyak 3 ml media nutrient agar cair, dimasukkan ke dalam tabung reaksi, diletakkan pada sudut kemiringan 30-45° dan dibiarkan memadat, kemudian disimpan di lemari pendingin Lay, 1994. 3.10 Pembiakan Bakteri 3.10.1 Pembuatan stok kultur

3.10.1.1 Bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli

Satu koloni bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia colidiambil dengan menggunakan jarum ose steril lalu masing-masing ditanamkan pada media nutrient agar miring dengan cara menggores, setelah itu diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37°C selama 18-24 jam Ditjen POM RI., 1995.

3.10.1.2 Peremajaan bakteri

Satu koloni bakteri diambil dengan menggunakan jarum ose steril, lalu ditanam pada media NA miring dengan cara menggores, kemudian diinkubasi dalam inkubator pada suhu 36-37 o C selama 18-24 jam. Peremajaan ini dilakukan sebanyak 3 kali Depkes RI, 1995.

3.10.1.3 Pembuatan larutan Standar McFarland No. 0,5

Sebanyak 0,05 ml larutan BaCl 2 1 dicampur dengan 9,95 ml larutan H 2 SO 4 1 dan dikocok homogen. Larutan Standart McFarland No.0,5 ini setara Universitas Sumatera Utara 32 dengan suspensi sel bakteri konsentrasi 10 8 CFUml Difco and BBL Manual,

2009. 3.10.2 Pembuatan inokulum

3.10.2.1 Bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli

Koloni bakteri Staphylococcus aureus danEscherichia colidiambil dari stok kultur dengan jarum ose steril, lalu disuspensikan dalam tabung reaksi yang berisi 10 ml larutan nutrient broth NB, diinkubasi sampai didapat kekeruhan yang sama dengan larutan Standar Mc.Farland No.0,5, berarti konsentrasi bakteri adalah 10 8 CFUml, kemudian dilakukan pengenceran suspensi bakteri dengan memipet 0,1 ml inokulum bakteri dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi larutan nutrient broth NB sebanyak 9,9 ml dan divortex hingga homogen maka suspensi bakteri konsentrasinya sama dengan 10 6 CFUml.

3.11 Pembuatan Larutan Uji Ekstrak Etanol Kulit Buah Semangka Merah Berbiji