BAB 3 KERANGKA KONSEP DAN DEFINISI OPERASIONAL
3.1.
KERANGKA KONSEP PENELITIAN
3.2.
VARIABEL DAN DEFINISI OPERASIONAL PTEI Peritumoral Edema Index
Definisi : Adalah suatu indeks atau perbandingan antara ukuran tumor
dengan ukuran edema peritumoral. Cara Ukur : Dari hasil pemeriksaan radiologis, volume dari tumor dan
edema dapat diukur dan indeks edema dapat dihitung. Volume dapat dihitung dengan formula hitung volume bola :
Hubungan antara edema peritumoral dengan volume tumor dihitung dengan PTEI :
Alat Ukur : Volume tumor dan edema diukur melalui pemeriksaan MRI secara terkomputerisasi. Untuk data-data yang tidak diukur
dengan komputer, diukur secara manual dengan skala dan mistar.
abc v
× =
π
3 4
Tumor Edema
v v
v OeI
Tumor
+ =
Meningioma Intrakranial
PTEI VEGF
Universitas Sumatera Utara
Hasil Ukur : Hasil penghitungan akan didapat dalam satuan milimeter kubik mm
3
Coating antibody anti-VEGF-A manusia ditempelkan pada sumur-
sumur mikro.
, dan hasil penghitungan indeks akan mendapat satuan angka indeks.
VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
Definisi : VEGF adalah suatu faktor pertumbuhan dengan aktivitas
mitogenik spesifik terhadap endotel, berbentuk protein terglikosilasi berbentuk dimer dengan ikatan disulfida,
berukuran 34 – 46 kD. Cara Ukur : Kadar VEGF akan diukur dengan cara Sandwich ELISA
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay dengan perangkat pemeriksaan VEGFA Human ELISA kit, Abnova, Taiwan.
Pemeriksaan dilakukan dengan menggunakan ELISA analyser Chemwell 2910 Awareness Technology, Inc..
Prinsip Pengujian :
Keberadaan VEGF-A manusia pada sampel atau standar akan
berikatan dengan antibody yang telah ditempelkan pada sumur-
sumur mikro.
Universitas Sumatera Utara
Setelah dilakukan inkubasi, komponen-komponen biologis
dibuang dengan melakukan tahap pencucian. Antibodi terhadap
VEGF-A manusia yang telah dikonjugasikan dengan biotin
ditambahkan dan akan berikatan dengan VEGF-A yang telah
ditangkap oleh antibody yang telah ditambahkan pertama kali.
Setelah dilakukan inkubasi, antibody anti-VEGF-A manusia
yang terkonjugasi dengan biotin yang tidak berikatan akan dibuang
dengan tahap pencucian. Streptavidin-HRP ditambahkan
dan berikatan pada antibody anti- VEGF-A manusia yang
terkonjugasi dengan biotin.
Setelah dilakukan inkubasi, Streptavidin-HRP yang tidak
berikatan dibuang dengan tahap pencucian, kemudian larutan
substrat reaktif terhadap HRP ditambahkan pada sumur-sumur
pemeriksaan.
Reaksi antara substrat reaktif yang berikatan dengan HRP akan
menghasilkan produk berwarna berhubungan dengan proporsinya
terhadap keberadaan VEGF-A manusia yang terkandung dalam
sampel atau standar. Reaksi ini dihentikan dengan menambahkan
larutan bersifat asam. Kandungan VEGF-A didapat dengan
mengukur absorbansi pada 450 nm. Kurva standar dibuat dari 7
standar VEGF-A dengan beberapa pengenceran, sehingga kadar
VEGF-A sampel dapat ditentukan.
Universitas Sumatera Utara
Protokol Penelitian : Protokol Pengujian
Konsentrat buffer sebaiknya berada dalam temperature ruangan dan sebaiknya dilarutkan sebelum melakukan
prosedur pemeriksaan. Jika terbentuk kristal di dalam konsentrat buffer, dapat dihangatkan sedikit hingga terlarut
secara menyeluruh.
Buffer pencuci
Tuangkan 50 ml konsentrat buffer pencuci 20x ke dalam tabung 1000ml. Larutkan hingga mencapai volume 1000ml
dengan air de-ionisasi atau akuadest. Campurkan perlahan untuk menghindari pembentukan busa.Pindahkan ke dalam
botol pencuci dan simpan pada temperatur 2
o
hingga 25
o
C.Larutan buffer pencuci ini 1x stabil selama 30 hari.
Buffer penguji
Tuangkan semua isi 5ml kosentrat buffer penguji 20x ke dalam tabung 100ml. Larutkan hingga mencapai volume
100ml dengan akuadest. Campurkan perlahan untuk menghindari pembentukan busa. Simpan pada temperatur 2
o
hingga 8
o
C. Larutan buffer pencuci ini 1x stabil selama 30
hari
Konjugat Biotin
Larutan konjugat Biotin harus digunakan dalam waktu 30 menit setelah dilakukan pengenceran.Buatlah larutan 1:100
dari konsentrat konjugat Biotin dengan Buffer penguji 1x dalam tabung plastik bersih. 0,06ml konsentrat ditambahkan
5,94ml buffer penguji atau 0,12 ml konsentrat ditambahkan
11,88ml buffer penguji.
Universitas Sumatera Utara
Streptavidin-HRP
Larutan Streptavidin HRP harus digunakan dalam waktu 30 menit setelah dilakukan pengenceran.Buatlah larutan 1:100
dari konsentrat Streptavidin-HRP dengan Buffer penguji 1x dalam tabung plastik bersih. 0,06ml konsentrat ditambahkan
5,94ml buffer penguji atau 0,12 ml konsentrat ditambahkan
11,88ml buffer penguji.
Standar VEGF-A manusia
Rekonstitusi VEGF-A manusia standar dengan menambahkan akuadest.Volume rekonstitusi ditentukan dari
label tabung standar. Goyangkan atau campurkan perlahan untuk memastikan proses pelarutan yang homogen
konsentrasi standar rekonstitusi = 2 ngml.Rekonstitusikan standar selama 10-30 menit. Campurkan dengan baik
sebelum melakukan pelarutan berikutnya.Setelah digunakan, larutan standar yang tersisa tidak dapat disimpan dan harus
dibuang.Pelarutan standar dapat dilakukan secara langsung pada plat sumur mikro atau secara alternatif pada tabung
lain.Pipetkan 225 µl pengencer sampel pada setiap tabung.
Pipetkan 225 µl standar ter-rekonstitusi 2ngml ke dalam
tabung pertama, berikan tanda S1 dan kemudian campurkan konsentrasi 1ngml, pipetkan 225
µl larutan S1 ke dalam tabung kedua, berikan label S2 dan kemudian campurkan.
Lakukan dilusi serial 5 kali lagi sehingga dapat membentuk
kurva standar.Pengencer standar digunakan sebagai blanko.
Universitas Sumatera Utara
Prosedur penelitian:
1. Tentukan jumlah sumur yang akan dibutuhkan untuk
melakukan pengujian Jumlah sampel ditambahkan dengan blanko dan standar. Setiap sampel, standar,
blanko dan sampel control sebaiknya diuji sebagai duplo. Lepaskan sumur-sumur yang tidak dipakai dari pemegang
dan simpan dalam kantung aluminium dengan pengering yang telah disediakan pada temperatur 2
o
-8
o
2. Cucilah sumur mikro dua kali dengan sekitar 400µl,
Buffer pencuci pada setiap sumur dengan aspirasi berulang diantara pencucian. Diamkan buffer pencuci
selama sekitar 10-15 detik sebelum aspirasi. Perhatikan untuk tidak menggores permukaan sumur mikro.
Kosongkan sumur dan ketukkan perlahan sumur mikro pada handuk kertas tissue atau sponge penghisap untuk
menghilangkan buffer pencuci yang berlebihan. Gunakan sumur mikro segera setelah pencucian. Cara lain: sumur
mikro dapat diletakkan terbalik pada handuk kertas tissue atau sponge penghisap tidak lebih dari 15 menit.
Sumur mikro tidak boleh mengalami pengeringan. dengan
pengemasan ketat.
Universitas Sumatera Utara
3. Pengenceran standar:
Tambahkan 100 µl pengencer sampel duplo terhadap
semua sumur standar. Pipetkan 100 µl larutan standar
2000pgml duplo pada sumur A1 dan A2. Campurkan kandungan sumur A1 dan A2 dengan aspirasi dan ejeksi
berulang konsentrasi standar 1, S1 = 1000pgml, dan pindahkan 100
µl ke dalam tabung B1 dan B2. Lakukan proses pengenceran serial sebanyak 5 kali, membentuk
dua baris standar VEGF-A standar dengan konsentrasi 1000 hingga 15,6 pgml.
4. Tambahkan 100µl pengencer sampel duplo pada sumur
kosong blanko. 5.
Tambahkan 50µl pengencer sampel pada sumur sampel. 6.
Tambahkan 50µl sampel-sampel secara duplo pada sumur sampel.
7. Tutup dengan lapisan penutup dan inkubasikan pada
temperatur ruangan 18-25
o
8. Persiapkan konjugat biotin.
C selama 2 jam pada pengaduk plat mikro dengan 100rpm.
9. Lepaskan lapisan penutup. Cucilah sumur mikro
sebanyak 6 kali seperti pada tahap 2 dari protokol pengujian.
10. Tambahkan 100µl konjugat biotin.
11. Tutup dengan lapisan penutup dan inkubasikan pada
temperatur ruangan 18-25
o
12. Persiapkan Streptavidin-HRP.
C selama 1 jam pada pengaduk plat mikro dengan 100rpm.
13. Lepaskan lapisan penutup. Cucilah sumur mikro
sebanyak 6 kali seperti pada tahap 2 dari protokol pengujian.
Universitas Sumatera Utara
14. Tambahkan 100 µl Streptavidin-HRP yang telah
diencerkan pada semua sumur, termasuk sumur blanko. 15.
Tutup dengan lapisan penutup dan inkubasikan pada temperatur ruangan 18-25
o
16. Lepaskan lapisan penutup. Cucilah sumur mikro
sebanyak 6 kali seperti pada tahap 2 dari protokol pengujian.
C selama 1 jam pada pengaduk plat mikro dengan 100rpm.
17. Pipetkan 100µl larutan substrat TMB pada semua sumur.
18. Tutup dengan lapisan penutup dan inkubasikan pada
temperatur ruangan 18-25
o
19. Pengembangan warna pada plat sebaiknya terus
diperhatikan dan reaksi substrat di-stop sebelum tidak dapat diukur lagi. Penentuan waktu yang ideal untuk
setiap pengembangan warna harus dilakukan secara individual terhadap setiap pengujian.
C selama 30 menit. Hindari paparan terhadap cahaya.
20. Direkomendasikan untuk menambahkan larutan stop
ketika standar tertinggi telah berwarna biru gelap. Cara lain, dapat dengan menggunakan reader ELISA pada 620
nm. Reaksi substrat sebaiknya distop ketika standar 1 mencapai OD 0,9 – 0,95.
21. Stop reaksi enzimatik dengan memberikan 100µl larutan
stop secara cepat pada setiap sumur. Hasil harus dibaca segera setelah larutan stop diberikan atau dalam 1 jam
jika disimpan pada suhu 2-8
o
22. Baca absorbansi setiap sumur mikro pada
spektrofotometer menggunakan 450 nm sebagai gelombang cahaya primer dapat juga menggunakan 610 -
650nm. C dalam keadaan gelap.
Universitas Sumatera Utara
Alat Ukur : Pengukuran dilakukan dengan menggunakan ELISA analyser Chemwell 2910 Awareness Technology, Inc.
Hasil Ukur : Hasil ukur akan didapat dalam satuan pgml.
3.3.
HIPOTESIS
Terdapathubungan antara kadar VEGF dalam serum terhadap nilai PTEI pada penderita meningioma intrakranial.
Universitas Sumatera Utara
BAB 4 METODE PENELITIAN
Kategori