Muhammad Arsyad : Studi Isolasi Bakteri Rhizobium Yang Diinokulasikan Ke Dalam Dolomit Sebagai Pembawa Carrier Serta Pemanfaatannya Sebagai Pupuk Mikroba, 2010.
3.3.3. Preparasi Sampel
Sampel yang digunakan adalah Rhizobium hasil isolasi dari tanaman putri malu, yang diambil dari FMIPA USU. Pengambilan sampel dilakukan dengan mencabut putri malu
yang akarnya berbintil lalu bintilnya dikumpulkan. Kemudian dibawa ke Laboratorium
Biokimia FMIPA USU.
3.3.4. Isolasi Rhizobium dari Bintil Akar
Sampel yang telah dibawa ke laboratorium, kemudian diproses. Bintil akar dipilih dari tanaman putri malu yang tersedia kemudian bintil akar tersebut dicuci dengan
merendamnya ke dalam tabung reaksi yang berisi akuades selama 2 menit, dibiarkan selama 1 menit, kemudian disaring. Lalu bintil akar tersebut dimasukkan dalam tabung
reaksi. Dilanjutkan dengan disemprot dengan menggunakan alkohol 96 selama 10 detik. Lalu disemprot kembali dengan larutan klorok selama 10 menit dan dibilas dengan akuades
selama 2 menit. Kemudian bintil akar yang telah disterilkan tersebut dipencet atau digerus menggunakan gelas objek. Di tambah 1 mL akuades. Lalu bintil akar yang steril tersebut
digiling.
3.3.4.1. Isolasi Bakteri Rhizobium pada Media Selektif dengan Penambahan Congo Red
Satu ose dari suspensi yang sudah disiapkan sebelumnya diambil, kemudian digoreskan pada media YEMA + Congo Red. Lalu kultur diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24-48 jam. Pertumbuhan Rhizobium diamati dengan memperhatikan bentuk dan warnanya. Pada
umumnya koloni berwarna putih transparan, mukoid dan sedikit berlendir. Rhizobium yang diperoleh disimpan dalam lemari es pada suhu 4
o
C selama 24-48 jam. Bakteri yang diperoleh ditumbuhkan kembali pada medium YEMA dengan menggunakan metode gores
sinambung, lalu diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 - 48 jam. Tujuannya yaitu untuk memperoleh biakan murni dari bakteri Rhizobium.
Muhammad Arsyad : Studi Isolasi Bakteri Rhizobium Yang Diinokulasikan Ke Dalam Dolomit Sebagai Pembawa Carrier Serta Pemanfaatannya Sebagai Pupuk Mikroba, 2010.
3.3.4.2. Pengidentifikasian Bakteri Rhizobium dengan Metode Mikroskopis
Plat kaca atau gelas objek disterilkan dengan alkohol 96. Satu ose biakan media diambil. Kemudian diletakkan di atas plat kaca ditetesi akuades sebanyak 2 tetes lalu didiamkan
sampai kering. Plat kaca kemudian ditetesi dengan larutan kristal violet dan didiamkan selama 30 detik, lalu dicuci dengan akuades. Plat kaca ditetesi kembali dengan larutan
iodine dan didiamkan selama 30 detik, lalu dicuci dengan akuades. Kemudian ditetesi dengan larutan aseton alkohol dan didiamkan selama 30 detik, dicuci dengan akuades. Plat
kaca ditetesi kembali dengan larutan safranin dan didiamkan selama 30 detik, dan dicuci dengan akuades, dibiarkan mengering lalu diamati di bawah mikroskop. Difoto bakteri
Rhizobium yang diamati.
3.3.5. Pembuatan Starter Kultur
Biakan Rhizobium yang ditumbuhkan kembali pada YEMA kemudian diambil 1-2 ose dan dicampur dengan 100 mL Yeast Manitol Broth YMB dalam gelas erlenmeyer, lalu
dikocok dengan menggunakan alat pengocok shaker selama 9 hari pada temperatur kamar hingga diperoleh Starter Kultur.
3.3.6. Pencampuran Starter dengan Medium Pembawa Carrier
Dolomit sebagai medium pembawa ditimbang sebanyak 140 gram lalu disterilkan. Sterilisasi dilakukan pada suhu 121
o
C pada tekanan 1,02 atm selama 60 menit. Medium yang sudah disterilisasi dibagi wadah plastik dengan pembagian sebagai berikut :
1. Wadah I : 5 g Dolomit ditambahkan dengan 10 mL Starter 1:2
2. Wadah II : 5 g Dolomit ditambahkan dengan 15 mL Starter 1:3
3. Wadah III : 5 g Dolomit ditambahkan dengan 20 mL Starter 1:4
4. Wadah IV : 5 g Dolomit ditambahkan dengan 25 mL Starter 1:5
5. Wadah V : 5 g Dolomit ditambahkan dengan 30 mL Starter 1:6
Muhammad Arsyad : Studi Isolasi Bakteri Rhizobium Yang Diinokulasikan Ke Dalam Dolomit Sebagai Pembawa Carrier Serta Pemanfaatannya Sebagai Pupuk Mikroba, 2010.
Masing-masing wadah kemudian dibolak balik sehingga antara starter dengan media tercampur secara homogen lalu diinokulasikan dan disimpan selama 5 minggu pada
temperatur kamar.
3.3.7. Pengujian Jumlah Sel dari Medium Pembawa Carrier
Masing-masing wadah dengan perbandingan antara dolomit dengan starter kultur 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, ditimbang sebanyak 1 g dan dimasukkan dalam masing-masing 5 tabung
reaksi yang berbeda, kemudian ditambahkan dengan 10 mL akuades steril. Dikocok sampai homogen dengan menggunakan vortexs lalu didiamkan selama 1 menit atau sampai
partikel tanah mengendap.Sebanyak 1 mL diambil dengan menggunakan pipet volume kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu divortex pengenceran 10
-2
. Hal yang sama dilakukan sampai penegenceran 10
-9
. Suspensi diambil sebanyak 0,25 mL dan disebarkan pada medium YEMA + Congo Red dalam cawan petri dengan menggunakan
cawan sebar. Kemudian diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 – 48 jam. Isolasi Rhizobium dari media pembawa dilakukan dari minggu ke-1 sampai minggu ke-5. Hingga
diperoleh pupuk Rhizobium.
3.3.8. Pengujian Lapangan
Pupuk Rhizobium yang diperoleh kemudian diaplikasikan dalam bentuk tabur kedalam masing-masing pot tanaman kacang hijau. Kemudian diukur lebar daun, panjang daun,
diameter daun, tinggi batang dan diameter batang dengan menggunakan jangka sorong. Pengamatan yang dilakukan dari minggu ke-1 sampai minggu ke-4 dan dicatat hasil
pengamatan.
Muhammad Arsyad : Studi Isolasi Bakteri Rhizobium Yang Diinokulasikan Ke Dalam Dolomit Sebagai Pembawa Carrier Serta Pemanfaatannya Sebagai Pupuk Mikroba, 2010.
3.4. Bagan Penelitian 3.4.1. Bagan Penelitian Isolasi Bakteri Rhizobium Metode Dubey, 2006
3.4.1.1.Isolasi Pembuatan Pupuk Rhizobium dari Akar Tanaman Putri Malu
Mimosa pudica .L 3.4.1.1.1. Pembuatan Biakan Murni Stok Kultur Rhizobium
dicuci dengan akuades selama 2 menit dibiarkan 1 menit
disaring dimasukkan kedalam tabung reaksi
disemprot dengan alkohol 96 selama 10 detik disemprot dengan larutan klorok selama 10 detik
dibilas dengan akuades selama 2 menit digiling dengan menggunakan alu dan lumpang
ditambah 1 mL akuades steril diinokulasi 1 ose pada media YEMA +
Congo red pada cawan petri diinkubasikan pada suhu 37
o
C selama 24-48 jam
dilihat bentuknya diamati warnanya
dipisahkan dengan jarum ose
disimpan dalam lemari es pada suhu 4
o
C selama 24-48 jam uji mikroskop
dikembngbiakkan kembali untuk mendapatkan biakan murni pada medium YEMA dengan menggunakan metode gores sinambung
diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24-48 jam. Bintil akar tanaman putri malu
Mimosa pudica .L
Bintil akar tanaman putri malu Mimosa pudica .L
Bintil akar tanaman putri malu Mimosa pudica .L
Suspensi Bintil akar tanaman putri malu Mimosa pudica .L
Koloni berwarna putih Rhizobium
Koloni berwarna merah Agrobacterium
Campuran Koloni Rhizobium dan Agrobacterium
Hasil
Muhammad Arsyad : Studi Isolasi Bakteri Rhizobium Yang Diinokulasikan Ke Dalam Dolomit Sebagai Pembawa Carrier Serta Pemanfaatannya Sebagai Pupuk Mikroba, 2010.
3.4.1.1.2. Pembuatan Perbandingan Biakan Murni Rhizobium pada pembawa Carrier
diambil 1-2 ose isolat Rhizobium dolomit ditimbang sebanyak 140 gram
diinokulasikan kedalam media disterilkan di dalam autoklaf Yeast Manitol Broth YMB pada suhu 121
o
C dan tekanan digoyang selama 9 hari 1,02 atm selama 60 menit
pada temperatur kamar
diukur volume dengan variasi ditimbang sebanyak 5 gram 10 ml, 15 ml, 20 ml, 25 ml, 30 ml
dicampurkan starter kultur dengan dolomit dimasukkan ke dalam 5 wadah plastik yang
berbeda
didapat perbandingan 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 diinokulasikan selama 5 minggu pada temperatur
kamar Biakan murni Stok
Kultur Rhizobium
Starter kultur Dolomit {CaMgCO
3 2
}
Wadah V 5 gram
Dolomit + 30 mL
starter Wadah IV
5 gram Dolomit +
25 mL starter
Wadah III 5 gram
Dolomit + 20 mL
starter Wadah II
5 gram Dolomit +
15 mL starter
Wadah I 5 gram
Dolomit + 10 mL
starter
Rhizobium dalam serbuk dolomit Dolomit Steril
Muhammad Arsyad : Studi Isolasi Bakteri Rhizobium Yang Diinokulasikan Ke Dalam Dolomit Sebagai Pembawa Carrier Serta Pemanfaatannya Sebagai Pupuk Mikroba, 2010.
3.4.1.1.3. Perhitungan Jumlah Sel Pada pembawa Carrier
ditimbang sebanyak 1 gram dimasukkan kedalam masing-masing 5
tabung reaksi ditambahkan 10 mL akuades steril
dihomogenkan dengan vorteks didiamkan selama 1 menit
dipipet sebanyak 1 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi
dilakukan pengenceran 10
-2
– 10
-9
dengan vorteks
diambil sebanyak 0,25 mL disebarkan pada media YEMA + Congo red dalam cawan petri
diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24-48 jam dihitung jumlah sel pada pembawa carier dari minggu ke-1
sampai minggu ke -5 Rhizobium dalam serbuk dolomit
Filtrat Rhizobium Endapan serbuk
Suspensi Rhizobium Filtrat
Hasil
Muhammad Arsyad : Studi Isolasi Bakteri Rhizobium Yang Diinokulasikan Ke Dalam Dolomit Sebagai Pembawa Carrier Serta Pemanfaatannya Sebagai Pupuk Mikroba, 2010.
3.4.2. Pengaplikasian Pupuk Rhizobium Terhadap Tanaman Kacang Hijau Vigna radiata L.
3.4.2.1. Tanaman Kacang Hijau Vigna radiata L. Tanpa Penambahan Pupuk Rhizobium blanko
diambil secukupnya serta dimasukkan ke dalam wadah yang telah disediakan
ditambahkan akuades secukupnya dibiarkan terendam selama 10 menit
diambil 2 – 3 biji kacang hijau dimasukkan ke dalam wadah polibek yang telah diisi tanah
setinggi 20 cm + 5 gram dolomit yang telah dihomogenkan
diukur dan dihitung
diamati pertumbuhan tanaman kacang hijau dari minggu ke – 1 hingga ke – 4.
dicatat hasil pengamatan diulangi perlakuan yang sama pada tanaman
berikutnya Biji Kacang Hijau Vigna radiata L.
Biji Kacang Hijau Vigna radiata L. Yang Terendam
Biji yang bagus Biji Kacang Hijau Vigna
radiata L. Yang Terapung Biji yang rusak
Tanaman Kacang Hijau Vigna radiata L.
Diameter daun
Panjang daun
Lebar daun
Hasil Tinggi
batang Diameter
batang
Muhammad Arsyad : Studi Isolasi Bakteri Rhizobium Yang Diinokulasikan Ke Dalam Dolomit Sebagai Pembawa Carrier Serta Pemanfaatannya Sebagai Pupuk Mikroba, 2010.
3.4.2.2. Tanaman Kacang Hijau Vigna radiata L. Dengan Penambahan Pupuk Rhizobium.
diambil secukupnya serta dimasukkan ke dalam wadah yang telah disediakan
ditambahkan akuades secukupnya dibiarkan terendam selama 10 menit
diambil 2 – 3 kacang hijau dimasukkan ke dalam wadah polibek yang telah diisi tanah
setinggi 20 cm
ditambahkan dengan pupuk Rhizobium dengan perbandingan 1:2
diukur dan dihitung
diamati pertumbuhan tanaman kacang hijau dari minggu ke – 1 hingga ke – 4.
dicatat hasil pengamatan diulangi perlakuan yang sama pada
penambahan pupuk Rhizobium dengan perbandingan 1:3 ; 1:4 ; 1:5 ; 1:6
Biji Kacang Hijau Vigna radiata L.
Biji Kacang Hijau Vigna radiata L. Yang Terendam
Biji yang bagus Biji Kacang Hijau Vigna
radiata L. Yang Terapung Biji yang rusak
Tanaman Kacang Hijau Vigna radiata L.
Tinggi batang
Diameter daun
Panjang daun
Lebar daun
Hasil Diameter
batang
Muhammad Arsyad : Studi Isolasi Bakteri Rhizobium Yang Diinokulasikan Ke Dalam Dolomit Sebagai Pembawa Carrier Serta Pemanfaatannya Sebagai Pupuk Mikroba, 2010.
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Hasil Penelitian
Dari hasil penelitian pupuk mikroba dan pengaplikasian pada tanaman kacang hijau yang dilakukan, diperoleh hasil bahwa pertumbuhan kacang hijau dengan penambahan starter
kultur dan bentonit 1:6 memperlihatkan hasil yang paling baik dibandingkan dengan perbandingan 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, dan blanko. Hal ini dapat dilihat dari Tabel 4.1 dan 4.2
berikut ini :
Tabel 4.1. Data perhitungan jumlah koloni bakteri Rhizobium Sampel
Pengenceran Minggu
Minggu Minggu
Minggu Minggu
I II
III IV
V
Blanko 10
9
1 : 2 10
9
207 253
268 272
281 1 : 3
10
9
215 274
276 290
315 1 : 4
10
9
270 291
311 379
381 1 : 5
10
9
289 318
346 391
428 1 : 6
10
9
301 347
384 459
473
Tabel 4.2. Data Perhitungan jumlah total koloni Rhizobium Sampel Pengenceran
Minggu Minggu
Minggu Minggu
Minggu I
II III
IV V
Blanko 10
9
1 : 2 10
9
828 x 10
9
1012 x 10
9
1072 x 10
9
1088 x 10
9
1124 x10
9
1 : 3 10
9
860 x 10
9
1096 x 10
9
1104 x 10
9
1160 x 10
9
1260 x 10
9
1 : 4 10
9
1080 x10
9
1164 x 10
9
1244 x 10
9
1516 x 10
9
1525 x 10
9
1 : 5 10
9
1156 x10
9
1272 x 10
9
1384 x 10
9
1564 x 10
9
1712 x 10
9
1 : 6 10
9
1204 x10
9
1388 x 10
9
1536 x 10
9
1836 x 10
9
1892 x 10
9
Muhammad Arsyad : Studi Isolasi Bakteri Rhizobium Yang Diinokulasikan Ke Dalam Dolomit Sebagai Pembawa Carrier Serta Pemanfaatannya Sebagai Pupuk Mikroba, 2010.
Tabel 4.3. Data Hasil Pertumbuhan tanaman kacang hijau Vigna radiata L. per minggu
Perlakuan Minggu I
Lebar Daun cm
Panjang Daun cm
Diameter daun cm
Tinggi batang cm
Diameter batang cm
Blanko 1 2,2
4,1 0,1
1,3 0,2
Blanko 2 2,2
4,0 0,1
13,1 0,2
Blanko 3 2,3
4,1 0,1
13,4 0,2
1 : 2 2,2
7,9 0,1
18,5 0,2
1 : 3 2,4
6,7 0,1
16,5 0,2
1 : 4 2,4
4,0 0,1
16,3 0,3
1 : 5 2,6
6,5 0,1
15,6 0,3
1 : 6 2,7
6,8 0,1
17,1 0,2
1 : 2 2,4
6,0 0,1
16,5 0,2
1 : 3 2,7
5,4 0,1
15 0,2
1 : 4 2,5
7,3 0,1
16,5 0,25
1 : 5 2,3
7,8 0,1
17,3 0,25
1 : 6 2,4
7,1 0,1
17,8 0,25
1 : 2 2,4
7,4 0,15
18,6 0,2
1 : 3 2,4
5,8 0,15
20,1 0,3
1 : 4 2,3
7,1 0,1
16,5 0,2
1 : 5 2,3
6,0 0,15
17,8 0,3
1 : 6 2,4
6,5 0,1
15,4 0,2
1 : 2 2,7
8,1 0,1
10,6 0,25
1 : 3 2,5
70 0,1
18,9 0,25
1 : 4 2,4
7,4 0,1
17,4 0,3
1 : 5 2,3
6,2 0,15
18,8 0,25
1 : 6 2,8
7,9 0,1
21,3 0,35
Data selengkapnya disajikan pada Lampiran tabel 4.3.
4.1.1. Perhitungan Jumlah Sel Rhizobium
CFUml = V
df x
a CFu = Colony Forming Unit
a = Rata-rata jumlah koloni per petri agar Df = Faktor pengenceran
V = Volume Suspensi Biakan yang disebarkan
Muhammad Arsyad : Studi Isolasi Bakteri Rhizobium Yang Diinokulasikan Ke Dalam Dolomit Sebagai Pembawa Carrier Serta Pemanfaatannya Sebagai Pupuk Mikroba, 2010.
4.1.1.1. Pengamatan Minggu I
Pengenceran 1:2 CFUml =
25 ,
10 207
9
x = 828 x 10
9
4.1.1.2. Pengamatan Minggu II