Isolasi Bakteri Rhizobium pada Media Selektif dengan Penambahan Congo Red Tanaman Kacang Hijau Vigna radiata L. Tanpa Penambahan Pupuk Rhizobium blanko Pengamatan Minggu I

Muhammad Arsyad : Studi Isolasi Bakteri Rhizobium Yang Diinokulasikan Ke Dalam Dolomit Sebagai Pembawa Carrier Serta Pemanfaatannya Sebagai Pupuk Mikroba, 2010.

3.3.3. Preparasi Sampel

Sampel yang digunakan adalah Rhizobium hasil isolasi dari tanaman putri malu, yang diambil dari FMIPA USU. Pengambilan sampel dilakukan dengan mencabut putri malu yang akarnya berbintil lalu bintilnya dikumpulkan. Kemudian dibawa ke Laboratorium Biokimia FMIPA USU.

3.3.4. Isolasi Rhizobium dari Bintil Akar

Sampel yang telah dibawa ke laboratorium, kemudian diproses. Bintil akar dipilih dari tanaman putri malu yang tersedia kemudian bintil akar tersebut dicuci dengan merendamnya ke dalam tabung reaksi yang berisi akuades selama 2 menit, dibiarkan selama 1 menit, kemudian disaring. Lalu bintil akar tersebut dimasukkan dalam tabung reaksi. Dilanjutkan dengan disemprot dengan menggunakan alkohol 96 selama 10 detik. Lalu disemprot kembali dengan larutan klorok selama 10 menit dan dibilas dengan akuades selama 2 menit. Kemudian bintil akar yang telah disterilkan tersebut dipencet atau digerus menggunakan gelas objek. Di tambah 1 mL akuades. Lalu bintil akar yang steril tersebut digiling.

3.3.4.1. Isolasi Bakteri Rhizobium pada Media Selektif dengan Penambahan Congo Red

Satu ose dari suspensi yang sudah disiapkan sebelumnya diambil, kemudian digoreskan pada media YEMA + Congo Red. Lalu kultur diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24-48 jam. Pertumbuhan Rhizobium diamati dengan memperhatikan bentuk dan warnanya. Pada umumnya koloni berwarna putih transparan, mukoid dan sedikit berlendir. Rhizobium yang diperoleh disimpan dalam lemari es pada suhu 4 o C selama 24-48 jam. Bakteri yang diperoleh ditumbuhkan kembali pada medium YEMA dengan menggunakan metode gores sinambung, lalu diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 - 48 jam. Tujuannya yaitu untuk memperoleh biakan murni dari bakteri Rhizobium. Muhammad Arsyad : Studi Isolasi Bakteri Rhizobium Yang Diinokulasikan Ke Dalam Dolomit Sebagai Pembawa Carrier Serta Pemanfaatannya Sebagai Pupuk Mikroba, 2010.

3.3.4.2. Pengidentifikasian Bakteri Rhizobium dengan Metode Mikroskopis

Plat kaca atau gelas objek disterilkan dengan alkohol 96. Satu ose biakan media diambil. Kemudian diletakkan di atas plat kaca ditetesi akuades sebanyak 2 tetes lalu didiamkan sampai kering. Plat kaca kemudian ditetesi dengan larutan kristal violet dan didiamkan selama 30 detik, lalu dicuci dengan akuades. Plat kaca ditetesi kembali dengan larutan iodine dan didiamkan selama 30 detik, lalu dicuci dengan akuades. Kemudian ditetesi dengan larutan aseton alkohol dan didiamkan selama 30 detik, dicuci dengan akuades. Plat kaca ditetesi kembali dengan larutan safranin dan didiamkan selama 30 detik, dan dicuci dengan akuades, dibiarkan mengering lalu diamati di bawah mikroskop. Difoto bakteri Rhizobium yang diamati.

3.3.5. Pembuatan Starter Kultur

Biakan Rhizobium yang ditumbuhkan kembali pada YEMA kemudian diambil 1-2 ose dan dicampur dengan 100 mL Yeast Manitol Broth YMB dalam gelas erlenmeyer, lalu dikocok dengan menggunakan alat pengocok shaker selama 9 hari pada temperatur kamar hingga diperoleh Starter Kultur.

3.3.6. Pencampuran Starter dengan Medium Pembawa Carrier

Dolomit sebagai medium pembawa ditimbang sebanyak 140 gram lalu disterilkan. Sterilisasi dilakukan pada suhu 121 o C pada tekanan 1,02 atm selama 60 menit. Medium yang sudah disterilisasi dibagi wadah plastik dengan pembagian sebagai berikut : 1. Wadah I : 5 g Dolomit ditambahkan dengan 10 mL Starter 1:2 2. Wadah II : 5 g Dolomit ditambahkan dengan 15 mL Starter 1:3 3. Wadah III : 5 g Dolomit ditambahkan dengan 20 mL Starter 1:4 4. Wadah IV : 5 g Dolomit ditambahkan dengan 25 mL Starter 1:5 5. Wadah V : 5 g Dolomit ditambahkan dengan 30 mL Starter 1:6 Muhammad Arsyad : Studi Isolasi Bakteri Rhizobium Yang Diinokulasikan Ke Dalam Dolomit Sebagai Pembawa Carrier Serta Pemanfaatannya Sebagai Pupuk Mikroba, 2010. Masing-masing wadah kemudian dibolak balik sehingga antara starter dengan media tercampur secara homogen lalu diinokulasikan dan disimpan selama 5 minggu pada temperatur kamar.

3.3.7. Pengujian Jumlah Sel dari Medium Pembawa Carrier

Masing-masing wadah dengan perbandingan antara dolomit dengan starter kultur 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, ditimbang sebanyak 1 g dan dimasukkan dalam masing-masing 5 tabung reaksi yang berbeda, kemudian ditambahkan dengan 10 mL akuades steril. Dikocok sampai homogen dengan menggunakan vortexs lalu didiamkan selama 1 menit atau sampai partikel tanah mengendap.Sebanyak 1 mL diambil dengan menggunakan pipet volume kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu divortex pengenceran 10 -2 . Hal yang sama dilakukan sampai penegenceran 10 -9 . Suspensi diambil sebanyak 0,25 mL dan disebarkan pada medium YEMA + Congo Red dalam cawan petri dengan menggunakan cawan sebar. Kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 – 48 jam. Isolasi Rhizobium dari media pembawa dilakukan dari minggu ke-1 sampai minggu ke-5. Hingga diperoleh pupuk Rhizobium.

3.3.8. Pengujian Lapangan

Pupuk Rhizobium yang diperoleh kemudian diaplikasikan dalam bentuk tabur kedalam masing-masing pot tanaman kacang hijau. Kemudian diukur lebar daun, panjang daun, diameter daun, tinggi batang dan diameter batang dengan menggunakan jangka sorong. Pengamatan yang dilakukan dari minggu ke-1 sampai minggu ke-4 dan dicatat hasil pengamatan. Muhammad Arsyad : Studi Isolasi Bakteri Rhizobium Yang Diinokulasikan Ke Dalam Dolomit Sebagai Pembawa Carrier Serta Pemanfaatannya Sebagai Pupuk Mikroba, 2010. 3.4. Bagan Penelitian 3.4.1. Bagan Penelitian Isolasi Bakteri Rhizobium Metode Dubey, 2006 3.4.1.1.Isolasi Pembuatan Pupuk Rhizobium dari Akar Tanaman Putri Malu Mimosa pudica .L 3.4.1.1.1. Pembuatan Biakan Murni Stok Kultur Rhizobium dicuci dengan akuades selama 2 menit dibiarkan 1 menit disaring dimasukkan kedalam tabung reaksi disemprot dengan alkohol 96 selama 10 detik disemprot dengan larutan klorok selama 10 detik dibilas dengan akuades selama 2 menit digiling dengan menggunakan alu dan lumpang ditambah 1 mL akuades steril diinokulasi 1 ose pada media YEMA + Congo red pada cawan petri diinkubasikan pada suhu 37 o C selama 24-48 jam dilihat bentuknya diamati warnanya dipisahkan dengan jarum ose disimpan dalam lemari es pada suhu 4 o C selama 24-48 jam uji mikroskop dikembngbiakkan kembali untuk mendapatkan biakan murni pada medium YEMA dengan menggunakan metode gores sinambung diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24-48 jam. Bintil akar tanaman putri malu Mimosa pudica .L Bintil akar tanaman putri malu Mimosa pudica .L Bintil akar tanaman putri malu Mimosa pudica .L Suspensi Bintil akar tanaman putri malu Mimosa pudica .L Koloni berwarna putih Rhizobium Koloni berwarna merah Agrobacterium Campuran Koloni Rhizobium dan Agrobacterium Hasil Muhammad Arsyad : Studi Isolasi Bakteri Rhizobium Yang Diinokulasikan Ke Dalam Dolomit Sebagai Pembawa Carrier Serta Pemanfaatannya Sebagai Pupuk Mikroba, 2010.

3.4.1.1.2. Pembuatan Perbandingan Biakan Murni Rhizobium pada pembawa Carrier

diambil 1-2 ose isolat Rhizobium dolomit ditimbang sebanyak 140 gram diinokulasikan kedalam media disterilkan di dalam autoklaf Yeast Manitol Broth YMB pada suhu 121 o C dan tekanan digoyang selama 9 hari 1,02 atm selama 60 menit pada temperatur kamar diukur volume dengan variasi ditimbang sebanyak 5 gram 10 ml, 15 ml, 20 ml, 25 ml, 30 ml dicampurkan starter kultur dengan dolomit dimasukkan ke dalam 5 wadah plastik yang berbeda didapat perbandingan 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 diinokulasikan selama 5 minggu pada temperatur kamar Biakan murni Stok Kultur Rhizobium Starter kultur Dolomit {CaMgCO 3 2 } Wadah V 5 gram Dolomit + 30 mL starter Wadah IV 5 gram Dolomit + 25 mL starter Wadah III 5 gram Dolomit + 20 mL starter Wadah II 5 gram Dolomit + 15 mL starter Wadah I 5 gram Dolomit + 10 mL starter Rhizobium dalam serbuk dolomit Dolomit Steril Muhammad Arsyad : Studi Isolasi Bakteri Rhizobium Yang Diinokulasikan Ke Dalam Dolomit Sebagai Pembawa Carrier Serta Pemanfaatannya Sebagai Pupuk Mikroba, 2010.

3.4.1.1.3. Perhitungan Jumlah Sel Pada pembawa Carrier

ditimbang sebanyak 1 gram dimasukkan kedalam masing-masing 5 tabung reaksi ditambahkan 10 mL akuades steril dihomogenkan dengan vorteks didiamkan selama 1 menit dipipet sebanyak 1 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi dilakukan pengenceran 10 -2 – 10 -9 dengan vorteks diambil sebanyak 0,25 mL disebarkan pada media YEMA + Congo red dalam cawan petri diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24-48 jam dihitung jumlah sel pada pembawa carier dari minggu ke-1 sampai minggu ke -5 Rhizobium dalam serbuk dolomit Filtrat Rhizobium Endapan serbuk Suspensi Rhizobium Filtrat Hasil Muhammad Arsyad : Studi Isolasi Bakteri Rhizobium Yang Diinokulasikan Ke Dalam Dolomit Sebagai Pembawa Carrier Serta Pemanfaatannya Sebagai Pupuk Mikroba, 2010.

3.4.2. Pengaplikasian Pupuk Rhizobium Terhadap Tanaman Kacang Hijau Vigna radiata L.

3.4.2.1. Tanaman Kacang Hijau Vigna radiata L. Tanpa Penambahan Pupuk Rhizobium blanko

diambil secukupnya serta dimasukkan ke dalam wadah yang telah disediakan ditambahkan akuades secukupnya dibiarkan terendam selama 10 menit diambil 2 – 3 biji kacang hijau dimasukkan ke dalam wadah polibek yang telah diisi tanah setinggi 20 cm + 5 gram dolomit yang telah dihomogenkan diukur dan dihitung diamati pertumbuhan tanaman kacang hijau dari minggu ke – 1 hingga ke – 4. dicatat hasil pengamatan diulangi perlakuan yang sama pada tanaman berikutnya Biji Kacang Hijau Vigna radiata L. Biji Kacang Hijau Vigna radiata L. Yang Terendam Biji yang bagus Biji Kacang Hijau Vigna radiata L. Yang Terapung Biji yang rusak Tanaman Kacang Hijau Vigna radiata L. Diameter daun Panjang daun Lebar daun Hasil Tinggi batang Diameter batang Muhammad Arsyad : Studi Isolasi Bakteri Rhizobium Yang Diinokulasikan Ke Dalam Dolomit Sebagai Pembawa Carrier Serta Pemanfaatannya Sebagai Pupuk Mikroba, 2010.

3.4.2.2. Tanaman Kacang Hijau Vigna radiata L. Dengan Penambahan Pupuk Rhizobium.

diambil secukupnya serta dimasukkan ke dalam wadah yang telah disediakan ditambahkan akuades secukupnya dibiarkan terendam selama 10 menit diambil 2 – 3 kacang hijau dimasukkan ke dalam wadah polibek yang telah diisi tanah setinggi 20 cm ditambahkan dengan pupuk Rhizobium dengan perbandingan 1:2 diukur dan dihitung diamati pertumbuhan tanaman kacang hijau dari minggu ke – 1 hingga ke – 4. dicatat hasil pengamatan diulangi perlakuan yang sama pada penambahan pupuk Rhizobium dengan perbandingan 1:3 ; 1:4 ; 1:5 ; 1:6 Biji Kacang Hijau Vigna radiata L. Biji Kacang Hijau Vigna radiata L. Yang Terendam Biji yang bagus Biji Kacang Hijau Vigna radiata L. Yang Terapung Biji yang rusak Tanaman Kacang Hijau Vigna radiata L. Tinggi batang Diameter daun Panjang daun Lebar daun Hasil Diameter batang Muhammad Arsyad : Studi Isolasi Bakteri Rhizobium Yang Diinokulasikan Ke Dalam Dolomit Sebagai Pembawa Carrier Serta Pemanfaatannya Sebagai Pupuk Mikroba, 2010. BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil Penelitian

Dari hasil penelitian pupuk mikroba dan pengaplikasian pada tanaman kacang hijau yang dilakukan, diperoleh hasil bahwa pertumbuhan kacang hijau dengan penambahan starter kultur dan bentonit 1:6 memperlihatkan hasil yang paling baik dibandingkan dengan perbandingan 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, dan blanko. Hal ini dapat dilihat dari Tabel 4.1 dan 4.2 berikut ini : Tabel 4.1. Data perhitungan jumlah koloni bakteri Rhizobium Sampel Pengenceran Minggu Minggu Minggu Minggu Minggu I II III IV V Blanko 10 9 1 : 2 10 9 207 253 268 272 281 1 : 3 10 9 215 274 276 290 315 1 : 4 10 9 270 291 311 379 381 1 : 5 10 9 289 318 346 391 428 1 : 6 10 9 301 347 384 459 473 Tabel 4.2. Data Perhitungan jumlah total koloni Rhizobium Sampel Pengenceran Minggu Minggu Minggu Minggu Minggu I II III IV V Blanko 10 9 1 : 2 10 9 828 x 10 9 1012 x 10 9 1072 x 10 9 1088 x 10 9 1124 x10 9 1 : 3 10 9 860 x 10 9 1096 x 10 9 1104 x 10 9 1160 x 10 9 1260 x 10 9 1 : 4 10 9 1080 x10 9 1164 x 10 9 1244 x 10 9 1516 x 10 9 1525 x 10 9 1 : 5 10 9 1156 x10 9 1272 x 10 9 1384 x 10 9 1564 x 10 9 1712 x 10 9 1 : 6 10 9 1204 x10 9 1388 x 10 9 1536 x 10 9 1836 x 10 9 1892 x 10 9 Muhammad Arsyad : Studi Isolasi Bakteri Rhizobium Yang Diinokulasikan Ke Dalam Dolomit Sebagai Pembawa Carrier Serta Pemanfaatannya Sebagai Pupuk Mikroba, 2010. Tabel 4.3. Data Hasil Pertumbuhan tanaman kacang hijau Vigna radiata L. per minggu Perlakuan Minggu I Lebar Daun cm Panjang Daun cm Diameter daun cm Tinggi batang cm Diameter batang cm Blanko 1 2,2 4,1 0,1 1,3 0,2 Blanko 2 2,2 4,0 0,1 13,1 0,2 Blanko 3 2,3 4,1 0,1 13,4 0,2 1 : 2 2,2 7,9 0,1 18,5 0,2 1 : 3 2,4 6,7 0,1 16,5 0,2 1 : 4 2,4 4,0 0,1 16,3 0,3 1 : 5 2,6 6,5 0,1 15,6 0,3 1 : 6 2,7 6,8 0,1 17,1 0,2 1 : 2 2,4 6,0 0,1 16,5 0,2 1 : 3 2,7 5,4 0,1 15 0,2 1 : 4 2,5 7,3 0,1 16,5 0,25 1 : 5 2,3 7,8 0,1 17,3 0,25 1 : 6 2,4 7,1 0,1 17,8 0,25 1 : 2 2,4 7,4 0,15 18,6 0,2 1 : 3 2,4 5,8 0,15 20,1 0,3 1 : 4 2,3 7,1 0,1 16,5 0,2 1 : 5 2,3 6,0 0,15 17,8 0,3 1 : 6 2,4 6,5 0,1 15,4 0,2 1 : 2 2,7 8,1 0,1 10,6 0,25 1 : 3 2,5 70 0,1 18,9 0,25 1 : 4 2,4 7,4 0,1 17,4 0,3 1 : 5 2,3 6,2 0,15 18,8 0,25 1 : 6 2,8 7,9 0,1 21,3 0,35 Data selengkapnya disajikan pada Lampiran tabel 4.3.

4.1.1. Perhitungan Jumlah Sel Rhizobium

CFUml = V df x a CFu = Colony Forming Unit a = Rata-rata jumlah koloni per petri agar Df = Faktor pengenceran V = Volume Suspensi Biakan yang disebarkan Muhammad Arsyad : Studi Isolasi Bakteri Rhizobium Yang Diinokulasikan Ke Dalam Dolomit Sebagai Pembawa Carrier Serta Pemanfaatannya Sebagai Pupuk Mikroba, 2010.

4.1.1.1. Pengamatan Minggu I

Pengenceran 1:2 CFUml = 25 , 10 207 9 x = 828 x 10 9

4.1.1.2. Pengamatan Minggu II