Prebiotik Separasi Fraksi Karbohidrat

6

B. Prebiotik

Gibson dan Roberfroid 1995 seperti diacu dalam Fanworth 2001 mendefinisikan prebiotik sebagai bahan pangan yang tidak dapat dicerna nondigestible yang menguntungkan bagi inang dengan menstimulasi secara selektif pertumbuhan dan atau aktivitas bakteri tertentu dalam kolon inang. Salminen et al. 2004 a menyebutkan bahwa suatu ingredien pangan dapat diklasifikasikan sebagai prebiotik jika memenuhi persyaratan berikut 1 tidak terhidrolisis atau terserap pada saluran pencernaan bagian atas, 2 secara selektif dapat menstimulir pertumbuhan bakteri yang menguntungkan pada kolon, dan 3 dapat menekan pertumbuhan bakteri patogen, sehingga secara sistemik dapat meningkatkan kesehatan. Prebiotik merupakan suatu konsep untuk meningkatkan jumlah bakteri target tertentu yang telah ada dalam kolon. Sasaran peningkatan jumlah bakteri tersebut adalah produksi asam lemak rantai pendek SCFA - Short Chain Fatty Acid karena pengaruhnya terhadap lingkungan saluran pencernaan bagian bawah, metabolisme, dan pencegahan penyakit tertentu Fanworth, 2001. Prebiotik pada umumnya merupakan karbohidrat dengan bobot molekul rendah yang tidak dapat diserap dan dicerna serta umumnya berbentuk oligosakarida dan serat pangan Silalahi dan Hutagalung, 2002. Salminen et al. 2004 a menyatakan bahwa oligosakarida dalam kacang-kacangan yang terdiri atas rafinosa dan stakiosa ternyata dapat dicerna oleh Bifidobacterium spp. Konsumsi bahan prebiotik secara signifikan dapat memodulasi komposisi mikroflora kolon yang menyebabkan Bifidobacteria lebih dominan dan banyak ditemukan dalam feses Gibson dan Robertfroid, 1995. Pada percobaan pertumbuhan lima jenis bakteri asam laktat laktat Lactobacillus casei galur Shirota, L. casei galur Rhamnosus, Lactobacillus G3, Bifidobacterium longum dan B. bifidum secara in vitro yang dilakukan oleh Putri 2005 diketahui bahwa kelima jenis BAL 7 tersebut dapat menggunakan ektrak oligosakarida umbi talas sebagai sumber gula untuk mendukung pertumbuhannya.

C. Oligosakarida

Oligosakarida adalah gula yang mengandung 2-20 unit sakarida atau dengan kata lain, oligosakarida adalah suatu polisakarida rantai pendek. Sebagian terdapat secara alami dalam sayur-sayuran dan buah-buahan sementara sebagian lainnya dapat diproduksi secara sintetis melalui hidrolisis polisakarida atau melalui penggunaan teknologi enzim Gibson Angus, 2000. Berdasarkan keseragaman monosakarida penyusunnya, oligosakarida dapat diklasifikasikan menjadi dua jenis, yaitu homo- oligosakarida dan hetero-oligosakarida. Homo-oligosakarida adalah adalah tipe oligosakarida yang tersusun dari satu jenis sakarida saja, sedangkan hetero-oligosakarida adalah tipe oligosakarida yang tersusun atas dua jenis atau lebih monosakarida. Oligosakarida bersifat sangat mudah larut dalam air atau pelarut polar lainnya Pazur, 1970. Oligosakarida adalah karbohidrat sederhana, banyak dikonsumsi dalam bentuk minuman ringan, biskuit, gula-gulabonbon, dan produk. lainnya. Oligosakarida fungsional adalah polisakarida pendek dengan struktur kimia yang unik sehingga tidak dapat dicerna oleh enzim-enzim pada percernaan manusia. Jadi oligosakarida fungsional pada akhirnya akan sampai di dalam usus besar. Dengan demikian, oligosakarida tertentu dapat menjadi media yang baik untuk pertumbuhan bakteri Bifidobacteria yang menguntungkan di dalam usus besar kolon. Dengan peningkatan jumlah bakteri ini, pertumbuhan bakteri pembusuk yang merugikan dapat ditekan, yakni Escherichia coli dan Streptococcus faecalis Silalahi dan Hutagalung, 2002. Lebih lanjut Silalahi dan Hutagalung 2002 menyebutkan bahwa peningkatan jumlah bifidobakteria sesudah mengkonsumsi oligosakarida akan mencegah pertumbuhan bakteri patogen yang masuk dari luar tubuh dan bakteri saluran pencernaan yang merugikan. Karena konsumsi oligosakarida akan mendukung produksi asam lemak rantai pendek terutama asam asetat dan asam laktat dengan perbandingan 3:2 dan 8 kemampuan untuk menghasilkan zat yang bersifat antimikroba. Hampir semua zat yang diproduksi oleh bakteri bersifat asam sebagai hasil fermentasi karbohidrat oligosakarida. Dengan terbentuknya zat-zat antibakteri dan asam maka pertumbuhan bakteri patogen seperti Salmonella dan E. coli akan dihambat. Tomomatsu 1994 diacu dalam Silalahi dan Hutagalung 2002 menyebutkan bahwa konsumsi oligosakarida akan mengurangi metabolit toksis dan enzim-enzim yang merugikan. Konsumsi 3-6 g oligosakarida per hari, akan mengurangi senyawa-senyawa toksis yang ada dalam usus dan enzim-enzim yang merugikan sebanyak 44,6 dan 40,9, masing-masing selama tiga minggu. Beberapa jenis karbohidrat kandidat prebiotik lainnya selain rafinosa adalah inulin, oligosakarida kedelai, galakto-oligosakarida, isomalto-oligosakarida, gentio-oligisakarida, xylo-oligosakarida, laktulosa, stakiosa, sorbitol, xylitol, palatinosa dan laktosukrosa Fanworth, 2001. Fruktooligosakarida merupakan jenis oligosakarida yang tidak dapat dicerna yang tersusun atas glukosil-fruktosil n-1 -fruktosa GF n dan fruktosil m -1-fruktosa F m . Inulin GF n dan hidrolisat inulin F m dikenal dengan nama oligofruktosa terdapat secara alami dalam berbagai tanaman seperti bawang, asparagus, bawang perai, pisang dan gandum, serta terdapat dalam akar chicory sebagai sediaan energi utamanya. Inulin diproduksi secara komersial dari akar chicory melalui ekstraksi dengan air panas a Salminen et al., 2004. Oligofruktosa selama ini dapat diperoleh dengan dua cara berbeda, yaitu melalui hidrolisis enzim parsial inulin yang berasal dari chicory, dan melalui sintesis dari sukrosa menggunakan fruktosil transferase Franck, 2000. Fruktooligosakarida difermentasi secara selektif oleh sebagian besar BAL galur bifidobakteria. Konsumsi fruktooligosakarida 4-20 gramhari secara selektif menstimulasi pertumbuhan bifidobakteri pada manusia Salminen et al., 2004 a . Inulin dan oligofruktosa dalam sistem pencernaan manusia tidak mengalami perubahan signifikan karena struktur spesifik ikatan β 2-1 9 yang dimilikinya tidak dapat dihidrolisis oleh enzim pencernaan manusia. Senyawa ini akan sampai ke dalam usus besar dan difermentasi oleh mikroba Franck, 2000. Fermentasi FOS secara spesifik dilakukan dengan β-fruktofuranosidase yang terasosiasi dengan sel bifidobakteri Manning dan Gibson, 2004. Gambar 2.2 . Struktur kimia a oligofruktosa dan b inulin Anonim, 2007 Rafinosa merupakan salah satu jenis oligosakarida yang dapat dimurnikan dari beberapa tanaman umumnya dari bit putih Salminen et al., 2004 a . Oligosakarida jenis ini merupakan trisakarida yang terdiri dari monomer fruktosa, galaktosa dan glukosa dengan titik leleh 78 o C Pazur, 1970. Menurut penelitian Benno dan rekannya 1984 di dalam Salminen et al. 2004 a , pemberian 15 gram rafinosa perhari selama 4 minggu telah meningkatkan jumlah bifidobakteria di feses manusia secara signifikan. Rafinosa dapat dimetabolisme oleh mikroflora usus sehingga dihasilkan asam laktat, asam asetat, asam butirat, hidrogen peroksida, bakteriosin dan metabolit lainnya Mishra dan Lambert, 1996. Rafinosa tidak dapat dicerna karena mukosa usus mamalia tidak mempunyai enzim α- galaktosidase, sehingga oligosakarida tersebut tidak dapat diserap oleh tubuh. Di dalam usus, oligosakarida ini akan difermentasi oleh bakteri- bakteri yang ada dalam usus, sehingga terbentuk gas karbondioksida, hidrogen, dan metan. Oligosakarida yang mengandung ikatan α- fruktosil glukosil fruktosil n n b a 10 galaktosida pada bahan pangan terkait dengan timbulnya flatulensi, yaitu suatu keadaan menumpuknya gas-gas dalam lambung Muchtadi, 1989. Putri 2005 menyatakan bahwa kandungan maltosa, rafinosa dan sukrosa dalam ekstrak oligosakarida talas mentega masing-masing adalah sebesar 369.66 ppm, 50.88 ppm dan 103.31 ppm. Pada kromatografi kertas ekstrak oligosakarida talas mentega juga ditemukan spot gula rafinosa, fruktosa dan oligosakarida lainnya, sedangkan pada hasil kromatografi kertas ekstrak oligosakarida talas ketan tidak ditemukan spot oligosakarida, tetapi ditemukan spot gula yang mendekati spot glukosa dan sukrosa. Gambar 2.1 dibawah ini menunjukan struktur kimia rafinosa. Gambar 2.2 . Struktur kimia rafinosa [ β-D-Fruktofuranosil 0-α-D Galaktopiranosil-1-6- α-D-Galaktopiranosida] Anonim, 2006 D. Bakteri Asam Laktat Bakteri asam laktat BAL mempunyai ciri tipikal Gram positif, tidak membentuk spora, katalase negatif, sama sekali tidak mempunyai sitokrom, nonaerobik tetapi aerotoleran, tahan terhadap asam, menghasilkan asam laktat sebagai produk akhir utama dalam fermentasi gula. BAL umumnya dihubungkan dengan habitat yang kaya nutrisi seperti berbagai macam produk atau bahan pangan susu, daging, minuman dan sayur-sayuran, tetapi beberapa juga merupakan anggota flora normal mulut, usus, dan vagina mamalia. Umum terjadi variasi dalam sifat BAL yang telah disebutkan di atas, hanya sifat Gram positif yang tidak dapat diganggu gugat. Genus yang memiliki ciri-ciri umum tipikal BAL adalah Aerococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus 11 dan Streptococcus. Genus Bifidobacterium dalam Bergeys Manual of Determinative Bacteriology-1957 masuk sebagai kategori Lactobacillus bifidum, meskipun demikian Bifidobacterium secara filogenetik lebih terhubung dengan grup bakteri Gram positif Actinomycetaceae. Genus Bifidobacterium memiliki jalur fermentasi gula yang unik dan berbeda, sehingga membedakannya dari grup BAL. Taksonomi BAL selanjutnya mengalami revisi yang cukup besar pada Bergeys Manual of Determinative Bacteriology-1986, khususnya untuk genus Streptokoki. Genus Streptococcus pertama-tama dibagi menjadi tiga genus berbeda; Enterococcus, Lactococcus, dan Streptococcus sensu stricto. Selanjutnya beberapa BAL yang bersifat motil yang serupa Laktokoki, digabung dalam genus lain yang berbeda, yaitu Vagococcus. Genus Lactobacillus, Leuconostoc dan Pediococcus umumnya tetap tidak berubah, kecuali beberapa BAL yang berbentuk batang yang semula tergabung dalam genus Lactobacillus, sekarang membentuk genus Carnobacterium, dan spesies Pediococcus halophilus telah menjadi genus baru, yaitu Tetragenococcus. Klaster BAL yang berbeda secara filogenetik, termasuk beberapa spesies yang sebelumnya digabungkan dalam genus Lactobacillus atau Leuconostoc, telah disarankan menjadi genus lain yang berbeda, yaitu Weisella. Leuconostoc oenos telah diajukan untuk ditentukan sebagai genus baru yaitu Oenococcus. Genus baru yaitu Alloiococcus, Dolosicoccus, Dolosigranulum, Eremococcus, Facklamia, Globicatella, Helcoccus, Ignavigranum dan Lactosphaera, juga mengandung beberapa galur yang bertalian dengan grup BAL, baik secara filogenetik maupun secara fisiologis Axxelson, 2004. Bakteri asam laktat diklasifikasikan menurut tipe fermentasi asam laktat yaitu homofermentatif dan heterofermentatif. Bakteri homofermentatif melakukan fermentasi homolaktat karena hanya menghasilkan asam laktat sebagai produk fermentasinya, sedangkan bakteri heterofermentatif selain memproduksi asam laktat juga memproduksi asam asetat, etanol dan karbondioksida sebagai hasil fermentasi. Bakteri asam laktat yang tergolong homofermentatif misalnya 12 Leuconostoc dan beberapa species Lactobacillus. Bakteri asam laktat yang tergolong heterofermentatif adalah Streptococcus, Pediacoccus dan beberapa spesies Lactobacillus Fardiaz, 1989. Organ mulut, lambung dan usus kaya akan mikroflora alami yang menghuninya, baik dari segi jenis maupun jumlahnya. Esofagus dan lambung memiliki jenis mikroflora yang hampir sama, namun variasi jumlah dan jenis mikrofloranya meningkat sepanjang saluran pencernaan dengan konsentrasi tertinggi di bagian kolon. Cairan lambung hanya mengandung sejumlah kecil bakteri dan kamir, yaitu 10 2 -10 3 ml saat mencerna. Namun setelah pencernaan selesai jumlah bakterinya meningkat 100-1000 kali lipat dari jumlah awalnya. Peningkatan jumlah ini dapat disebabkan adanya mikroflora yang ikut masuk bersama makanan. Lambert dan Hull, 1996. Lebih lanjut Lambert dan Hull 1996 menyatakan beberapa jenis BAL yang mendominasi lambung dan usus adalah Lactococcus, Lactobacillus spp., Leuconostoc dan Bifidobacterium. Kemampuan BAL untuk menempel di permukaan mukosa usus dan bersaing dengan mikroflora lainnya serta produksi senyawa antibakteri menyebabkannya dapat bersaing dengan patogen lain yang tahan terhadap asam dan cairan empedu. Beberapa jenis penyakit dan masalah kesehatan yang dapat dibantu dikurangi oleh BAL adalah intoleransi laktosa, infeksi enterik, diare, diare akibat konsumsi antibiotik, konstipasi dan kanker usus Salminen et al, 2004 b .

a. Lactobacillus sp.

Lactobacillus adalah genus BAL dengan jumlah anggota terbesar dengan karakteristik yang sangat beragam karakter fenotip, biokimia dan fisiologis. Karakteristik umum bakteri ini adalah berbentuk batang, dapat memproduksi karbondioksida dari glukosa dapat bersifat homofermentatif maupun heterofermentatif, dapat tumbuh pada suhu 10 o C, 6.5 NaCl dan pH 4.4, namun tidak dapat tumbuh pada 18 NaCl 13 dan pH 9.6 Axelsson, 1998. Lactobacillus dapat tahan terhadap asam lambung dan dapat melewatinya sehingga dapat mencapai usus halus dan kolon. Bakteri jenis ini dapat bertahan pada kondisi dengan pH 4 selama beberapa minggu secara in vitro Lambert dan Hull, 1996. Lactobacillus casei Shirota yang lebih dikenal sebagai bakteri Yakult, merupakan bakteri yang diisolasi pertama kali oleh Dr. Minoru Shirota, seorang ahli mikrobiologi dari Jepang. Lactobacillus casei Shirota mempunyai morfologi bentuk batang, berada dalam koloni tunggal maupun berantai, mempunyai panjang 1.5-5.0 μm dan lebar 0.6- 0.7 μm, bersifat Gram positif, katalase negatif, tidak membentuk endospora maupun kapsul, tidak mempunyai flagella, anaerobik fakultatif, hidup dengan baik pada suhu optimum15-41 o C dan pH 3.5 atau lebih Selamat, 1992. Lactobacillus casei Rhamnosus bersifat homofermentatif, gram positif, katalase negatif, dan tidak membentuk spora Buchanan Gibbons, 1974. Selain itu bakteri ini termasuk dalam golongan bakteri asam laktat yang bersifat termobakterium karena bakteri ini dapat tumbuh pada suhu 45 o C Robinson, 1981. Rastal dan Vatsala 2002 menyebutkan bahwa L. casei Rhamnosus hanya dapat memfermentasi FOS oligomer trsisakarida dan tetrasakarida, dan tidak memfermentasi pentasakarida. L. rhamnosus dan L. casei Shirota bermanfaat dalam mencegah dan mengobati infeksi gastrointestinal tertentu, termasuk diare rotavirus pada anak-anak dan diare yang berhubungan dengan antibiotik dan perawatan radiasi panggul Sandholm-Mattila, 2000.

b. Bifidobacterium sp.

Bakteri dari genus Bifidobakteria berbentuk batang, Gram positif dan tidak membentuk spora. Morfologi selnya biasanya lengkung dan secara ekstrim dapat membengkak dan dapat membentuk percabangan, namun biasa pula ditemukan bentuk bulat maupun bentuk batang dengan panjang yang bervariasi. Berbagai macam bentuk tersebut bentuk V, Y, 14 atau X lebih dipengaruhi komposisi medium kultur. Pertumbuhan optimum bakteri ini adalah pada kisaran pH 6.5-7.0. Untuk spesies Bifidobacterium yang berasal dari manusia temperatur optimum pertumbuhannya adalah 36-38 o C, sedangkan untuk spesies yang berasal dari hewan suhu optimum pertumbuhannya lebih tinggi, yakni pada 41- 43 o C Ballongue, 2004. Karakteristik utama Bifidobakteria menurut Greed et al. 1957 adalah bersifat Gram positif, anaerob obligat pada kultur primer dan kemudian menjadi mikroaerofilik atau anaerob fakultatif. Bifidobacterium bifidum mempunyai efek menguntungkan bagi tubuh seperti dapat melindungi usus dari bakteri atau khamir patogen, menghasilkan asam asetat dan asam laktat sehingga menciptakan kondisi usus yang asam dan tidak dapat dihuni oleh bakteri berbahaya, mencegah pertumbuhan bakteri yang mampu mengubah senyawa nitrat dalam usus yang berasal dari makanan dan minuman menjadi senyawa nitrit yang bersifat prokarsinogenik, menghasilkan vitamin B dan membantu fungsi hati dalam proses pencernaan makanan Chaitow dan Trenev, 1990. Selain itu B. bifidum dapat pula menghasilkan suatu antibiotik yaitu Bifidin yang sangat efektif melawan Shigella dysentria, Salmonella typhosa, Staphylococcus aureus, E. coli dan bakteri lainnya Tomomatsu, 1994 diacu oleh Silalahi dan Hutagalung, 2002. B. bifidum dapat memfermentasi fruktosa, galakatosa, sukrosa dan melibiosa, namun tidak dapat memfermentasi rafinosa, maltosa dan inulin Ballongue, 2004. Bifidobacterium longum berbentuk batang, tidak terjadi pertumbuhan pada suhu kurang dari 20 o C, tidak memiliki resistensi terhadap suhu lebih dari 46 o C, dan pH awal optimal untuk pertumbuhannya adalah 6.5-7.0 Ballongue, 1998. Yuguchi et al. 1992 menyebutkan B. longum tidak membentuk spora, berukuran 2-8 μm, katalase negatif, suhu optimum untuk pertumbuhannya adalah 36-38 o C dan akan mati pada suhu 60 o C. B. longum dapat memfermentasi rafinosa, xylosa, mannosa, fruktosa, galaktosa, sukrosa dan meilibiosa, tetapi tidak dapat memfermentasi inulin Ballongue, 2004. 15

E. Separasi Fraksi Karbohidrat

Kromatografi merupakan metode pemisahan yang memerlukan waktu singkat dan lebih efektif dibandingkan dengan pemisahan lainnya, dengan kromatografi dapat dilakukan pemisahan yang tidak mungkin dilakukan dengan metode lain Nur et al., 1987. Dari beberapa jenis kromatografi yang umum digunakan untuk separasi kromatografi kolom, kromatografi lapis tipis, kromatografi gas, dan lain-lain, metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode kromatografi kertas. Woods dan Aurand 1977 menyebutkan kromatografi kertas merupakan metode yang baik untuk mengidentifikasi gula secara kualitatif, khususnya jika jumlah gula yang terdapat pada larutan relatif sedikit. Pada dasarnya prinsip pemisahan pada kromatografi adalah perbedaan distribusi pada dua fase berbeda yaitu fase bergerak dan fase tetap. Kromatografi kertas tergolong dalam kategori kromatografi partisi, dimana zat akan terdistribusi di antara dua cairan sebagai fase bergerak dan fase tetap. Pada kromatografi partisi konvensional, fase tetap bersifat lebih polar daripada fase gerak, senyawa yang paling tidak polar akan memiliki waktu retensi yang paling rendah atau Rf paling tinggi dalam kromatografi lapisan. Pada kromatografi kertas fase tetapnya adalah air pelarut yang lebih polar yang terimobilisasi dalam serat selulosa Houghton dan Raman, 1998. Woods dan Aurand 1977 menyebutkan secara umum urutan nilai Rf gula pada kromatografi kertas adalah; pentosa paling tinggi, heksosa, disakarida, dan trisakarida. Sementara Horowitz 1980 menyatakan nilai Rf sangat dipengaruhi oleh gugus hidroksil gula. Nilai Rf berhubungan dengan interaksi antara gugus hidroksil dari gula melalui ikatan hidrogennya dengan air sebagai fase diam. Jumlah gugus hidroksil ekuatorial yang semakin tinggi akan menghasilkan nilai Rf gula semakin rendah di dalam pelarut organik sebagai fase bergerak. Selain kombinasi sistem pelarut propil alkohol-etil asetat-air seperti yang digunakan dalam penelitian ini, pelarut lain yang dapat digunakan untuk mengisolasi 16 oligosakarida dengan kromatografi kertas adalah sistem pelarut butil alkohol-piridin-benzena-air. 17

III. METODOLOGI

A. Bahan-bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam pembuatan tepung talas kontrol dan tepung talas perlakuan yaitu umbi talas mentega dan air. Bahan-bahan kimia yang digunakan meliputi etanol 70 vv, aquades, Pb-asetat CICA TM jenuh, propanol Merck TM , etil asetat Merck TM , difenilamin Merck TM , anilin Merck TM , asam ortofosfat Merck TM dalam aseton Merck TM , kertas Whatman No. 1, rafinosa Difco TM , maltosa Merck TM , sukrosa Flucka TM , glukosa Merck TM , fruktosa Sigma TM , inulin Merck TM dan oligofruktosa Orafti TM P95. Bahan-bahan yang digunakan dalam uji pertumbuhan BAL in vitro adalah kultur BAL, proteose peptone Difco TM , yeast exract Difco TM , Tween 80 Merck TM , dipotasium hidrogen fosfat Merck TM , sodium asetat Merck TM , MgSO 4 .7H 2 O Difco TM , dan MnSO 4 .4H 2 O Merck TM , akuades, bacto agar Difco TM , dan gliserol Univar TM . Bahan-bahan untuk pengujian prebiotik umbi talas adalah tikus percobaan, kultur BAL, dan bahan-bahan pakan standar maizena Honig TM , minyak jagung China Corn Oil TM , kasein, premix vitamin Fitkom TM , premix mineral, selulosa dan akuades. Bahan-bahan media yang digunakan adalah MRS deMann Rogosa Sharpe Broth Oxoid TM , MRS deMann Rogosa Agar Oxoid TM , larutan fisiologis NaCl 0.85, EMBA Eosin Methylene Blue Agar Difco TM , LB Lactose Broth Difco TM , SCB Selenite Cystine Broth Oxoid TM , BSA Bismuth Sulfite Agar Oxoid TM , HEA Hectone Enteric Agar Oxoid TM dan TSIA Triple Sugar Iron Agar Oxoid TM . B. Alat-Alat Penelitian Alat-alat yang digunakan untuk membuat tepung talas kontrol dan perlakuan adalah pisau, neraca, oven, baskomwadah, ayakan 60 mesh, slicer, kukusan, Whilley mill, wajan, sodet dan kompor. Alat untuk ekstraksi oligosakarida yaitu magnetic stirer, sentrifuge, evaporator vakum, tabung reaksi, botol penyemprot, gelas ukur, dan gelas piala. Alat-alat yang digunakan dalam tahap uji pertumbuhan BAL adalah alat-