3.5 Pemeriksaan Parameter Imun Udang 3.5.1
Total Hemosit.
Jumlah hemosit dihitung sesuai metode Blaxhall dan Daisley 1973. 0,1 ml hemolim diambil dari pangkal kaki renang, menggunakan srynge 1 ml berisi 0,9 ml antikoagulan Na-sitrat,
kemudian dihomogenkan, dengan cara menggerakkan tangan membentuk angka delapan selama 5 menit. Satu tetes larutan diletakkan pada hemocytometer dan jumlah sel per ml dihitung.
1000 1
× ×
× Σ
− =
FP besar
kotak Volume
terhitung sel
rata Rata
hemosit Total
3.5.2 Diferensial Hemosit
Dihitung dengan cara: hemolim diteteskan pada gelas objek dan dibuat ulasan, dikeringkan dan difiksasi dengan metanol selama 5 menit. Kemudian dikering udarakan dan diwarnai dengan
larutan giemsa selama 10 menit, dicuci dengan air mengalir dan dibiarkan kering. Ulasan kemudian diperiksa di bawah mikroskop dengan pembesaran 100 kali.
100 ×
= hemosit
Total hemosit
sel jenis
tiap Jumlah
hemosit Sel
Jenis Persentase
3.5.3 Indeks Fagositik.
Hemolim udang dimasukkan sebanyak 0,1 ml ke dalam mikroplate dan dicampur secara merata dengan 25 µl bakteri Staphylococcus aureus dan diinkubasi selama 20 menit. Kemudian
sebanyak 5 µl diteteskan pada objek glass dan dibuat preparat ulas. Selanjutnya difiksasi dengan Metanol 100 selama 5 menit dan diwarnai dengan Giemsa 10 selama 15 menit. Aktifitas
fagositosis diukur berdasarkan presentase sel-sel fagosit yang menunjukkan proses fagositosis Anderson dan Siwicki, 1993.
100 ×
= fagosit
sel Jumlah
s fagositosi
melakukan yang
fagosit sel
Jumlah Fagositik
Indeks
3.5.4 Aktifitas Phenoloxidase PO
Untuk mengukur aktifitas phenoloxidase secara spektrofotometer oleh perekaman pembentukan dopachrome yang dihasilkan dari
L
-dihydroxyphenylalanine
L
-DOPA Hernandez- Lopez et al., 1996, hemolim yang diencerkan disentrifus pada 700
× g pada 4
o
C selama 20 menit; cairan supernatant dibuang dan pellet dibilas, disuspensikan kembali secara perlahan dalam
cacodylate-citrate buffer 0,01 M sodium cacodylate, 0,45 M sodium chloride, 0,10 M trisodium citrate, pH 7,0 dan disentrifuse ulang. Pellet kemudian diresuspended dengan 200
µl cacodylate
buffer 0,01 M sodium cacodylate, 0,45 M sodium chloride, 0,01 M calcium chloride, 0,26 M magnesium chloride, pH 7,0 dan 100
µl aliqout diinkubasi dengan 50 µl trypsin 1 mg ml
-1
, sebagai aktifator, selama 10 menit pada 25-26
o
C; 50 µl
L
-DOPA ditambahkan, diikuti oleh 800 µl
cacodylate buffer 5 menit kemudian. Optical density pada 490 nm diukur menggunakan spektrofotometer Hitachi U-2000. Optical density aktifitas phenoloxidase udang untuk semua
kondisi uji diekspresikan sebagai pembentukan dopachrome dalam 50 µl hemolim.
3.5.5 Clearance efficiency
