b.Pembuatan kurva kalibrasi Dibuat seri larutan baku dari zat yang akan dianalisis dengan berbagai
konsentrasi. Masing-masing absorbansi larutan dengan berbagai konsentrasi diukur, kemudian dibuat kurva yang merupakan hubungan antara absorbansi
dengan konsentrasi. c. Pembacaan absorbansi sampel atau cuplikan
Absorbansi yang terbaca spektrofotometri antara 0,2-0,6. Anjuran ini berdasarkan anggapan bahwa kisaran nilai absorbansi tersebut kesalahan yang paling minimal.
2.7.1 Pengertian Spektrofotometri UV-Vis
Spektrofotometri UV-Vis adalah istilah yang digunakan ketika radiasi ultraviolet dan cahaya tampak diabsorpsi oleh molekul yang diukur. Alatnya
disebut UV-Vis spektrofotometer. Spektrofotometer UV-Vis UltraViolet-Visible adalah salah satu dari sekian banyak instrumen yang biasa digunakan dalam
menganalisa suatu senyawa kimia. Spektrofotometer umum digunakan karena kemampuannya dalam menganalisa begitu banyak senyawa kimia serta
kepraktisannya dalam hal preparasi sampel apabila dibandingkan dengan beberapa metode analisa.
Spektrofotometri UV-Vis merupakan pengukuran serapan cahaya di daerah ultraviolet 200-400 nm dan sinar tampak 400-800 nm oleh suatu
senyawa. Serapan cahaya UV atau cahaya tampak mengakibatkan transisi elektronik, yaitu promosi elektron-elektron dari orbital keadaan dasar yang
berenergi rendah ke orbital keadaan tereksitasi berenergi lebih tinggi. Panjang gelombang cahaya UV atau cahaya tampak bergantung pada mudahnya promosi
Universitas Sumatera Utara
elektron. Molekul-molekul yang memerlukan lebih banyak energi untuk promosi
elektron, akan menyerap pada panjang gelombang yang lebih pendek. Molekul yang memerlukan energi lebih sedikit akan menyerap pada panjang gelombang
yang lebih panjang. Senyawa yang menyerap cahaya dalam daerah tampak senyawa berwarna mempunyai elektron yang lebih mudah dipromosikan dari
pada senyawa yang menyerap pada panjang gelombang lebih pendek Rohman,2010. Adapun Kegunaan Spektrofotometer UV- Vis adalah:
1. Membandingkan panjang gelombang maksimum
2. Membandingkan serapan A, daya serap a
3. Membandingkan harga serapan relatif
4. Membandingkan spektrum serapannya
2.7.2 Komponen Spektrofotometer UV-Vis
Komponen-komponen yang terpenting dari suatu spektrofotometer UV-Vis terdiri dari sumber spektrum, monokromator, sel pengabsorpsi, dan detektor.
1. Sumber : sumber yang biasa digunakan pada spektroskopi absorpsi adalah lampu
wolfram. Arus cahaya tergantung pada tegangan lampu. Lampu hidrogen atau lampu deuterium digunakan untuk sumber pada daerah UV-Vis. Kebaikan lampu
wolfram adalah energi radiasi yang dibebaskan tidak bervariasi pada berbagai panjang gelombang. Untuk memperoleh tegangan yang stabil dapat digunakan
transformator.
Universitas Sumatera Utara
2. Monokromator :digunakan untuk memperoleh sumber, sinar yang monokromatis.
Alatnya dapat berupa prisma ataupun grating. Untuk mengarahkan sinar monokromatis yang diinginkan dari hasil penguraian ini dapat digunakan celah.
3. Sel absorpsi : pada pengukuran di daerah tampak kuvet kaca atau kuvet kaca
corex dapat digunakan, tetapi untuk pengukuran pada daerah UV-Vis kita harus menggunakan sel kuarsa karena gelas tidak tembus cahaya. Umumnya tebal
kuvetnya adalah 10 mm, tetapi yang lebih kecil ataupun yang lebih besar dapat digunakan. Sel yang biasa digunakan berbentuk persegi tetapi bentuk silinder
dapat juga digunakan. Kita harus menggunakan kuvet yang bertutup untuk pelarut organik. Sel yang baik adalah kuarsa atau gelas hasil leburan serta seragam
keseluruhannya. 4.
Detektor : peranan detektor penerima adalah memberikan respon terhadap cahaya pada berbagai panjang gelombang Khopkar, 2003.
Pada spektrofotometri UV-Vis digunakan detektor spektrofotometri UV- Vis dimana detektor jenis ini merupakan detektor yang paling banyak digunakan
dan sangat berguna untuk analisis di bidang farmasi karena kebanyakan senyawa obat mempunyai struktur yang dapat menyerap sinar UV-Vis. Detektor ini
didasarkan pada adanya penyerapan radiasi ultraviolet UV dan sinar tampak Vis pada kisaran panjang gelombang 190-800 nm oleh spesies solute yang
mempunyai struktur-struktur atau gugus-gugus kromoforik. Sel detektor umumnya berupa tabung dengan diameter 1 mm dan panjang celah optiknya 10
mm, serta diatur sedemikian rupa sehingga mampu menghilangkan pengaruh indeks bias yang dapat mengubah absorbansi yang terukur.
Detektor spektrofotometri UV-Vis dapat berupa detektor dengan panjang
Universitas Sumatera Utara
gelombang tetap merupakan detektor yang paling sederhana serta detektor dengan panjang gelombang bervariasi. Detektor panjang gelombang tetap
menggunakan lampu uap merkuri sebagai sumber, energinya dan suatu filter optis yang akan memilih sejumlah panjang gelombang, misal 254, 380 dan 436 nm.
Panjang gelombang yang dipilih biasanya 254 nm karena kebanyakan senyawa obat menyerap di 254 nm sehingga panjang gelombang ini sangat berguna.
Detektor dengan panjang gelombang yang bervariasi lebih berguna dibanding dengan detektor pada panjang gelombang yang tetap Rohman, 2007.
2.7.3 Cara Kerja Spektrofotometer UV-Vis
