Bahan- bahan Pemeriksaan Mikroskopik Daun Segar - Penampang Melintang : Pembuatan Ekstrak Etanol

Faizal Amri Harahap : Karakterisasi Simplisia Dan Isolasi Serta Analisis Komponen Minyak Atsiri Dari Daun Nilam Pogostemon cablin Benth. Asal Aceh Tenggara, 2009. USU Repository © 2009 Stahl, mikroskop Olympus, seperangkat alat kromatografi lapis tipis, maserator, rotary evaporator Buchi 461, Kromatograf Gas – Spektrometer Massa GC-MS model Shimadzu QP 2010 S.

3.2 Bahan- bahan

Bahan- bahan yang digunakan adalah serbuk simplisia Pogostemonis cablin Folium. Bahan kimia yang digunakan berkualitas pro analisis E. Merck kecuali dinyatakan lain, yaitu toluen, kloralhidrat, kloroform, etanol, metanol, amil alkohol, n-heksan, etilasetat, serbuk magnesium, timbal II asetat, isopropanol, asam klorida, asam sulfat, bismuth III nitrat, kalium iodida, sudan III ,besi III klorida dan air suling. 3.3 Pembuatan Larutan Pereaksi 3.3.1 Pereaksi Dragendorff Sebanyak 8,0 g bismuth III nitrat dilarutkan dalam 20 ml asam nitrat. Sebanyak 27,2 g kalium iodida dilarutkan dalam 50 ml air suling. Kedua larutan dicampur dan didiamkan sampai memisah sempurna. Larutan jernih diambil dan diencerkan dengan air secukupnya sehingga 100 ml Ditjen POM, 1989.

3.3.2 Pereaksi Mayer

Sebanyak 1,36 g raksa II klorida dilarutkan dalam air suling hingga 60 ml. Pada wadah lain, 5 g kalium iodida dilarutkan dalam 10 ml air suling. Kemudian keduanya dicampurkan dan ditambahkan air suling hingga diperoleh volume 100 ml Ditjen POM, 1989. 3.3.3.Pereaksi Bouchardat Faizal Amri Harahap : Karakterisasi Simplisia Dan Isolasi Serta Analisis Komponen Minyak Atsiri Dari Daun Nilam Pogostemon cablin Benth. Asal Aceh Tenggara, 2009. USU Repository © 2009 Sebanyak 4 g kalium iodida dilarutkan dalam air suling secukupnya sampai KI larut dengan sempurna, lalu ditambahkan 2 g iodium sedikit demi sedikit dan dicukupkan dengan air suling hingga volume 100 ml Ditjen POM, 1989.

3.3.4 Pereaksi Besi III Klorida 1

Sebanyak 1 g besi III klorida dilarutkan dalam air suling sampai 100 ml Ditjen POM, 1989.

3.3.5 Perekasi Molish.

Sebanyak 3 g -naftol ditimbang dan dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N secukupnya hingga diperoleh larutan 100 ml Ditjen POM, 1989.

3.3.6 Pereaksi Timbal II Asetat 0,4 M

Sebanyak 15,17 g timbal II asetat dilarutkan dalam air suling bebas karbondioksida hingga 100 ml Ditjen POM, 1989.

3.3.7 Pereaksi Sudan III

Sebanyak 100 mg sudan III dilarutkan dalam campuran 10 ml etanol 95 dan 10 ml gliserol Ditjen POM, 1989.

3.3.8 Pereaksi Asam Sulfat 2 N

Sebanyak 10 ml asam sulfat pekat diencerkan dengan air suling hingga 100 ml. Ditjen POM, 1995 .

3.3.9 Pereaksi Asam Klorida 2 N

Sebanyak 17 ml asam klorida pekat diencerkan dengan air suling hingga 100 ml Ditjen POM, 1989.

3.3.10 Pereaksi Liebermann-Burchard

Faizal Amri Harahap : Karakterisasi Simplisia Dan Isolasi Serta Analisis Komponen Minyak Atsiri Dari Daun Nilam Pogostemon cablin Benth. Asal Aceh Tenggara, 2009. USU Repository © 2009 Untuk pereaksi kualitatif, sebanyak 20 bagian asam asetat anhidrida dicampur dengan 1 bagian asam sufat pekat. Untuk penyemprot, sebanyak 20 bagian asam asetat anhidrida dicampurkan dengan 1 bagian asam sulfat pekat dan 50 bagian kloroform. Larutan penyemprot ini harus dibuat baru Harborne, 1987.

3.3.11. Pereaksi Kloralhidrat

Sebanyak 50 g kloralhidrat ditimbang lalu dilarutkan dalam 20 ml air suling Ditjen POM, 1989.

3.4 Penyiapan Sampel

Penyiapan sampel meliputi pengambilan sampel, identifikasi tumbuhan dan pengolahan sampel.

3.4.1 Pengambilan Sampel

Pengumpulan sampel dilakukan secara purposif, tanpa membandingkan dengan tumbuhan yang sama dari daerah lain. Bahan diperoleh dari Kecamatan Blangkejeren, Kabupaten Gayo lues pemekaran dari Aceh Tenggara, Provinsi Nanggroe Aceh Darussalam.

3.4.2 Identifikasi Tumbuhan.

Identifikasi tumbuhan dilakukan di Pusat Penelitian Biologi LIPI Bogor. Hasil identifikasi dapat dilihat pada lampiran 1 halaman 50.

3.4.3 Pengolahan sampel

Sampel yang digunakan adalah daun nilam Pogostemon cablin Benth.. Tanaman nilam pada usia siap panen, diambil daunnya, disortir antara daun yang Faizal Amri Harahap : Karakterisasi Simplisia Dan Isolasi Serta Analisis Komponen Minyak Atsiri Dari Daun Nilam Pogostemon cablin Benth. Asal Aceh Tenggara, 2009. USU Repository © 2009 bagus dan yang tidak, kemudian dibersihkan dari kotoran yang melekat lalu dicuci dengan air bersih, ditiriskan dan disebar diatas koran sehingga airnya terserap, lalu ditimbang diperoleh sebanyak 4 kg sebagai berat basah, lalu daun nilam dikeringkan pada suhu 50 o C-60 o C pada lemari pengering. Daun dianggap kering jika diremas menjadi hancur. Daun yang sudah kering ini disebut simplisia. Simplisia disortasi kering, lalu ditimbang diperoleh sebanyak 1,1 kg. Simplisia selanjutnya disimpan dalam kantung plastik untuk mencegah pengaruh lembab dan pengotor lain.

3.5 Pemeriksaan Mikroskopik Daun Segar - Penampang Melintang :

Daun segar dipotong secara melintang dengan pisau pemotong, diletakkan di atas kaca objek yang sebelumnya telah ditetesi dengan kloralhidrat dan dipanaskan, kemudian ditutup dengan kaca penutup kemudian di lihat di bawah mikroskop. Gambar mikroskopik penampang melintang dapat dilihat pada lampiran 3 halaman 52. - Penampang Membujur : Daun segar dipotong secara membujur atas dan membujur bawah dengan pisau pemotong, diletakkan di atas kaca objek yang sebelumnya telah ditetesi dengan kloralhidrat dan dipanaskan, kemudian ditutup dengan kaca penutup kemudian dilihat di bawah mikroskop. Gambar mikroskopik penampang membujur dapat dilihat pada lampiran 4 halaman 53.

3.6 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia

Pemeriksaan karakteristik simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik, dan mikroskopik, penetapan kadar sari larut dalam etanol, penetapan kadar sari yang larut dalam air, penetapan kadar air, penetapan kadar abu total, penetapan kadar abu tidak larut dalam asam, penetapan kadar minyak Ditjen POM, 1989. Faizal Amri Harahap : Karakterisasi Simplisia Dan Isolasi Serta Analisis Komponen Minyak Atsiri Dari Daun Nilam Pogostemon cablin Benth. Asal Aceh Tenggara, 2009. USU Repository © 2009

3.6.1 Pemeriksaan Makroskopik

Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan cara mengamati rupa, bentuk, ukuran, bau, warna, rasa simplisia. Gambar simplisia Pogostemonis cablin Folium dapat dilihat pada lampiran 2 halaman 51.

2.6.2 Pemeriksaan Mikroskopik

Pemeriksaan mikroskopik serbuk simplisia Pogostemonis cablin Folium dengan cara meneteskan kloralhidrat diatas kaca objek kemudian diatasnya ditaburkan serbuk simplisia daun nilam dan ditutupi dengan cover glass kaca penutup kemudian dilihat dibawah mikroskop. Gambar mikroskopik serbuk simplisia dapat dilihat pada lampiran 5 halaman 54.

3.6.3 Penetapan Kadar Abu

Sebanyak 2 g serbuk simplisia yang telah ditimbang, dimasukkan ke dalam krus platina atau krus silika yang telah dipijarkan dan ditara, diratakan. Pijarkan perlahan-lahan hingga arang habis, dinginkan, timbang, jika dengan cara ini arang tidak dapat dihilangkan, ditambahkan air panas, disaring melalui kertas saring bebas abu. Sisa dan kertas saring dipijarkan dalam krus yang sama. Masukkan filtrat ke dalam krus, uapkan, pijarkan hingga bobot tetap, timbang. Hitung kadar abu terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Ditjen POM, 1995. Hasil perhitungan kadar abu dapat dilihat pada lampiran 9 halaman 58.

3.6.4 Penetapan Kadar Abu yang Tidak Larut dalam Asam

Abu yang diperoleh pada penetapan kadar abu, didihkan dengan 25 ml asam klorida encer P selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam dikumpulkan, saring melalui kertas saring bebas abu, cuci dengan air panas pijarkan hingga bobot Faizal Amri Harahap : Karakterisasi Simplisia Dan Isolasi Serta Analisis Komponen Minyak Atsiri Dari Daun Nilam Pogostemon cablin Benth. Asal Aceh Tenggara, 2009. USU Repository © 2009 tetap dan di timbang. Hitung kadar abu yang tidak larut dalam asam terhadap bahan yang telah dikeringkan diudara Ditjen POM, 1995. Hasil perhitungan kadar abu yang tidak larut dalam asam dapat dilihat pada lampiran 10 halaman 59.

3.6.5 Penetapan Kadar Air

Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi Alat : labu alas bulat 500 ml, alat penampung, pendingin, tabung penyambung, tabung penerima 5 ml. Cara : Ke dalam labu alas bulat dimasukkan 200 ml toluena dan 2 ml air, didestilasi selama 2 jam. Toluena didinginkan selama 30 menit dan volume air dalam tabung penerima dibaca. Kemudian ke dalam labu dimasukkan 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama. Labu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluena mendidih, kecepatan tetesan diatur 2 tetes untuk tiap detik sampai sebahagian besar air terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 tetes tiap detik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluena. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin sampai suhu kamar. Setelah air dan toluena memisah sempurna baca volume air dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air dibaca sesuai dengan kandungan air yang didalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen Ditjen POM, 1989. Hasil perhitungan kadar air dapat dilihat pada lampiran 11 halaman 46.

3.6.6 Penetapan Kadar Sari yang Tidak Larut dalam Air

Sebanyak 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama, dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air – kloroform 2,5 ml kloroform dalam air sampai 1 Faizal Amri Harahap : Karakterisasi Simplisia Dan Isolasi Serta Analisis Komponen Minyak Atsiri Dari Daun Nilam Pogostemon cablin Benth. Asal Aceh Tenggara, 2009. USU Repository © 2009 Liter dalam labu bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam kemudian disaring. Sejumlah 20 ml filtrat pertama diuapkan sampai kering dalam cawan penguap berdasar rata yang telah ditara dan dipanaskan pada suhu 105 o C sampai bobot tetap. Kadar sari larut dalam air dihitung terhadap bahan yang dikeringkan di udara Ditjen POM, 1989. Hasil perhitungan kadar sari larut dalam air dapat dilihat pada lampiran 12 halaman 61.

3.6.7 Penetapan Kadar Sari dalam Etanol

Sebangak 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama, dimaserasi selama 24 jam dalam etanol 95 dalam labu bersumbat dikocok sekali-kali selama 6 jam pertama, dibiarkan selama 18 jam. Kemudian disaring cepat untuk menghindari penguapan etanol, diambil 20 ml filtrat kemudian diuapkan sampai kering dalam cawan yang berdasar rata yang telah ditara dan dipanaskan pada suhu 105 o C sampai bobot tetap. Kadar sari larut dalam etanol dihitung terhadap bahan yang dikeringkan diudara Ditjen POM, 1989. Hasil Perhitungan kadar sari larut dalam etanol dapat dilihat pada lampiran 13 halaman 62.

3.6.8 Penetapan Kadar Minyak Atsiri

Penetapan kadar minyak atsiri dilakukan dengan mengunakan alat Stahl Gambar alat dapat dilihat pada Lampiran 6 Halaman 55 Caranya : Sebanyak 15 g serbuk simplisia dimasukkan ke dalam labu alas bulat berleher pendek, lalu ditambahkan air suling sebanyak 300 ml. Lalu diletakkan diatas pemanas listrik, labu dihubungkan dengan pendingin dan alat penampung berskala. Buret diisi dengan air hingga penuh, selanjutnya dilakukan destilasi. Volume minyak atsiri dicatat dan kadar minyak atsiri dihitung dalam vb Ditjen POM, 1979. Hal yang sama dilakukan untuk penetapaan kadar minyak atsiri pada Faizal Amri Harahap : Karakterisasi Simplisia Dan Isolasi Serta Analisis Komponen Minyak Atsiri Dari Daun Nilam Pogostemon cablin Benth. Asal Aceh Tenggara, 2009. USU Repository © 2009 ekstrak, dimana untuk ekstrak yang ditimbang sebanyak 5 g. Hasil perhitungan kadar minyak atsiri simplisia dan ekstrak dapat dilihat pada lampiran 14-15 halaman 63-64. Minyak atsiri yang diperoleh dianalisis secara KLT dan GC-MS. 3.7 Skrining Fitokimia Serbuk Simplisia 3.7.1. Pemeriksaan Alkaloid Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan diatas penangas air selama 2 menit, dinginkan dan disaring. Filtrat dipakai untuk percobaan berikut: a. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan 2 tetes larutan pereaksi Mayer, maka akan terbentuk endapan menggumpal berwarna putih atau putih kekuningan. b. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan 2 tetes larutan pereaksi Bouchardat, akan terbentuk berwarna coklat sampai hitam. c. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan 2 tetes larutan pereaksi Dragendorff, akan terbentuk endapan merah atau jingga. Alkaloid positif jika terjadi endapan atau kekeruhan paling sedikit pada dua dari tiga percobaan di atas Ditjen POM, 1989. Hasil dapat dilihat pada lampiran 8 tabel 1 halaman 57.

3.7.2 Pemeriksaan Saponin Uji busa

Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 10 ml air panas dan didinginkan, kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 detik. Saponin ditunjukkan dengan terbentuknya buih yang stabil selama tidak kurang dari 10 menit setinggi 1-10 cm, dengan penambahan 1 tetes asam klorida Faizal Amri Harahap : Karakterisasi Simplisia Dan Isolasi Serta Analisis Komponen Minyak Atsiri Dari Daun Nilam Pogostemon cablin Benth. Asal Aceh Tenggara, 2009. USU Repository © 2009 2 N, buih tidak hilang Ditjen POM, 1989. Hasil dapat dilihat pada lampiran 8 tabel 1 halaman 57.

3.7.3 Pemeriksaan Flavonoida

Sebanyak 0,5 g serbuk ditambahkan 10 ml metanol direfluks selama 10 menit, disaring dalam keadaan panas dan diencerkan dengan 10 ml air suling, setelah dingin ditambahkan 5 ml eter minyak tanah, dikocok hati-hati, lalu didiamkan sebentar, lapisan metanolnya diambil, diuapkan pada temperatur 40 o C, sisanya dilarutkan dalam 5 ml etil asetat, disaring. Filtratnya digunakan untuk uji flavonoida yaitu sebanyak 1 ml filtrat diuapkan sampai kering, sisa dilarutkan dalam 2 ml etanol 95 lalu ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 10 tetes asam klorida pekat, jika terjadi warna merah jingga sampai warna merah ungu menunjukkan adanya flavonoida Ditjen POM, 1989. Hasil dapat dilihat pada lampiran 8 tabel 1 halaman 57.

3.7.4 Pemeriksaan Tanin

Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia disari dengan 10 ml air suling lalu disaring, filtratnya diencerkan dengan air suling sampai tidak berwarna. Larutan diambil sebanyak 2 ml dan ditambahkan 1 - 2 tetes pereaksi FeCl 3 1 . Jika terjadi warna hijau kehitaman atau biru kehitaman maka menunjukkan adanya tanin Harborne, 1987 Hasil dapat dilihat pada lampiran 8 tabel 1 halaman 57.

3.7.5 Pemeriksaan Triterpenoid dan Steroid

Sebanyak 1 g serbuk simplisia direndam dengan 20 ml eter selama 2 jam. Disaring, lalu filtrat diuapkan dalam cawan penguap, dan pada sisanya ditambahkan 20 tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes asam sulfat pekat pereaksi Liebermann- Burchard. Apabila terbentuk warna biru, biru hijau, merah, merah muda, atau ungu Faizal Amri Harahap : Karakterisasi Simplisia Dan Isolasi Serta Analisis Komponen Minyak Atsiri Dari Daun Nilam Pogostemon cablin Benth. Asal Aceh Tenggara, 2009. USU Repository © 2009 menunjukkan adanya triterpenoid dan steroid Harborne, 1987. Hasil dapat dilihat pada lampiran 8 tabel 1 halaman 57.

3.7.6 Pemeriksaan Glikosida

Sebanyak 3 g serbuk simplisia disari dengan 30 ml campuran etanol 95 dengan air 70:30 dan 10 ml asam sulfat 2 N, direfluks selama 1 jam, didinginkan dan disaring. Pada 20 ml filtrat ditambahkan 25 ml air dan 25 ml timbal asetat 0,4 N, dikocok, didiamkan 5 menit lalu disaring. Filtrat dipartisi dengan 20 ml campuran isopropanol dan kloroform 20:30, dilakukan berulang sebanyak 3 kali, diambil lapisan air dan diuapkan. Sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol. Larutan sisa digunakan untuk percobaan sebagai berikut: 0,1 ml larutan percobaan dimasukkan dalam tabung reaksi, diuapkan diatas penangas air. Pada sisanya ditambahkan 2 ml air suling dan ditambahkan 5 tetes pereaksi Molish. Kemudian secara perlahan-lahan dimasukkan 2 ml asam sulfat pekat. Glikosida positif bila terbentuk cincin berwarna ungu pada batas cairan Ditjen POM, 1989. Hasil dapat dilihat pada lampiran 8 tabel 1 halaman 57.

3.7.7 Pemeriksaan Minyak Atsiri

Serbuk simplisia ditabur di atas kaca objek yang sebelumnya telah ditetesi kloralhidrat lalu ditambahkan dengan sudan III, dibiarkan selama 30 menit dalam bejana bertutup yang didalamnya terdapat cawan berisi etanol 90 , kemudian di lihat di bawah mikroskop. Bahan yang mengandung minyak atsiri berwarna merah jingga Ditjen POM, 1989. Hasil dapat dilihat pada lampiran 8 tabel 1 halaman 57.

3.8 Pembuatan Ekstrak Etanol

Pembuatan ekstrak dengan cara maserasi mengunakan pelarut etanol 95, 1 bagian serbuk simplisia daun nilam ditambahkan 10 bagian etanol 95 1:10 Faizal Amri Harahap : Karakterisasi Simplisia Dan Isolasi Serta Analisis Komponen Minyak Atsiri Dari Daun Nilam Pogostemon cablin Benth. Asal Aceh Tenggara, 2009. USU Repository © 2009 dimana 300 g serbuk simplisia daun nilam dibutuhkan 3 liter etanol, pertama-tama simplisia di serbuk kemudian di timbang sebanyak 300 g lalu di rendam sampai terendam sempurna selama 6 jam sambil sekali-kali diaduk kemudian dimasukkan ke dalam maserator lalu didiamkan selama 24 jam, kemudian ditampung maserat lalu tambahkan sisa etanol sampai 3 liter, maserat dikumpulkan kemudian proses diulangi sebanyak 2 kali dengan jenis dan jumlah pelarut yang sama. Semua maserat dikumpulkan dan diuapkan dengan penguap vakum, kemudian lakukan frees dryer sehingga diperoleh ekstrak kental, timbang ekstrak didapat beratnya 65,667 g. Diperoleh rendemennya 21,89 .