Reaksi PCR dilakukan dengan volume total 25 µl dari campuran larutan yang terdiri atas
2 µl DNA genom, 1 U enzim taq polimerase dan 10X buffernya New England Biolab; 2 mM dNTP mix; 2.5 mM MgCl
2
dan dH
2
O steril. Kondisi reaksi PCR dalam mesin thermocycler dirancang dengan suhu pradenaturasi 94
o
C selama 4 menit, selanjutnya 30 siklus reaksi yang terdiri atas denaturasi 95
o
C selama 30 detik, annealing suhu spesifik primer selama 1 menit, perpanjangan
72
o
C selama 1 menit. Pemanjangan akhir pada suhu 72
o
C selama 5 menit. Suhu annealing untuk primer gen GH 60
o
C.
d. Genotiping Teknik PCR-SSCP Tegelstrom 1992
Genotiping dengan teknik SSCP menggunakan elektroforesis gel poliakrilamid 10. Gel dibuat dengan cara pencampuran 14 ml air destilata; 2.5
ml larutan 5 x TBE; 8,3 ml larutan akrilamid 30; 15 µl larutan TEMED dan 150 µl APS 10. Sebanyak 2 µl produk PCR dicampur dengan + 25 µl loadying dye
bromthymol blue 0.01, xilene cyanol 0.01 dan gliserol 50. Elektroforesis dilakukan pada tegangan konstan 200 volt selama 16 jam. Setelah elektroforesis
selesai, gel diambil untuk dilakukan pewarnaan perak.
d. Visualisasi Pita DNA Tegelstrom 1992
Visualisasi pola pita hasil SSCP menggunakan metode silver stainning atau pewarnaan perak. Tahapan pewarnaan perak yaitu gel dicuci secara bertahap
sebagai berikut: dengan larutan AgNO
3
0.2 gram, 80 µl NaOH 10 N, 800µl ammonia dalam 200 ml air destilasi selama 8 menit, kemudian dibilas dengan air
destilasi selama 2 menit. Proses memunculkan pita dalam gel melalui gel perendam dalam larutan yang terdiri atas 6 gram NaOH200 ml air destilata
selama 6 menit ditambah 200 µl formaldehid. Setelah pita muncul, larutan asam
asetat dituangkan untuk penghentian aktifitas oksidasi perak oleh formaldehida.
II. Analisis Kualitas Susu Segar
Analisis kualitas susu segar meliputi pemeriksaan BJ, kadar lemak, kadar protein dan bahan kering tanpa lemak.
a. Analisis Berat Jenis Standar Nasional Indonesia 1992
Pengukuran berat jenis dilakukan dengan alat laktodensimeter. Sebanyak 100 ml susu pada suhu antara 20
C dimasukkan kedalam gelas ukur. Laktodensimeter dicelupkan perlahan-lahan. Nilai berat jenis dapat dibaca pada
skala yang tertera pada laktodensimeter, kemudian dilakukan penyetaraan pada suhu 27.5
C. Setiap perbedaan 1 C diatas atau di bawah 27.5
C maka nilai berat jenisnya ditambah atau dikurangi 0.0002.
b. Analisis Kadar Lemak Standar Nasional Indonesia 1992
Pengukuran kadar lemak menggunakan metode Gerber. Sebanyak 10 ml asam sulfat pekat dimasukkan kedalam butirometer, kemudian ditambahkan 10.5
ml susu secara hati-hati melalui dinding mulut butirometer dan ditambahkan 1 ml amilalkohol. Setelah butirometer ditutup dengan sumbat karet dan dihomogenkan,
butirometer dimasukkan ke dalam penangas air pada suhu 60
º
C selama ± 10 menit. Tahap selanjutnya adalah sentrifugasi dengan menggunakan sentrifuge
Gerber dengan kecepatan 1200 rpm selama 5 menit, kemudian butirometer dimasukkan kembali kedalam penangas air minimal 2 menit. Butirometer
dipegang vertikal dan karet penutup diatur, sehingga tepat pada suatu garis pada skala butirometer dan dibaca persen kadar lemaknya.
c. Analisis Kadar Protein Standar Nasional Indonesia 1992
Dua puluh lima mililiter susu, 1 ml larutan kalium oksalat dan 0.25 fhenolftalin dimasukkan kedalam gelas beker, dicampur hingga homogen,
dibiarkan selama 2 menit. Setelah homogen, campuran dititrasi dengan larutan NaOH dari buret sampai warnanya sama dengan warna standar merah muda,
kemudian larutan formalin sebanyak 2.5 ml ditambahkan kedalam campuran yang telah dititrasi, lalu dikocok hingga warna merah muda hilang, dibiarkan selama 1
menit. Campuran dititrasi kembali dengan NaOH sampai berwarna merah muda. Dihitung dan dicatat jumlah NaOH yang terpakai p ml. Blanko dibuat dengan 10
ml aquades ditambah 0.4 ml kalium oksalat jenuh, 2 ml formalin 40 serta 2-3 tetes fenolftalein 1, lalu dititrasi dengan larutan NaOH 0.1 N sampai terbentuk
warna merah muda dan dicatat banyaknya NaOH 0.1 N yang terpakai q ml.
