4.3. PENGUJIAN SAMPEL
4.3.1. Pengujian Sampel Serum
4.3.1.1. Uji Netralisasi Virus pada Biakan Sel Fluorescent Antibody Virus Neutralisasi TestFAVNT
Prinsip : Prinsip dari uji ini adalah reaksi netralisasi in vitro dengan virus yang titernya konstan. Virus
rabies yang digunakan adalah galur CVS yang sudah beradaptasi pada biakan sel BHK 2l Clone 13. Penetapan titer serum adalah enceran tertinggi serum yang menetralkan 100 virus pada
50 dari jumlah ulangan lubang-lubang uji. Titer serum dinyatakan dalam IUml International Unit dengan cara membandingkannya dengan serum standar pada kondisi uji yang sama pada
saat itu. Serum standar hewan anjing yaitu dari OIE atau serum standar orang dari WHO. FAVNT ini dikerjakan pada lempeng mikro microplate yang berisi 96 lubang dengan alas datar
dan steril.
Alat penting yang diperlukan : a.
Inkubator dengan suhu 37°C dengan 5 CO2, b.
Laminar cabinet, c.
Mikroskop fluoresensi. Reagensia dan bahan-bahan biologik:
a. Larutan PBS pH 7,2 tanpa Ca
2+
dan Mg
2+
, disimpan pada suhu 4°C, b.
Trypsin ethylen diamin tetra acetic acid EDTA c.
Aseton 80 high grade, diencerkan dengan air deionised, disimpan pada suhu 4°C, d.
Dulbecco Modified Eagle’s Medium DMEM + 10 Fetal Bovine Serum FBS, e.
Konjugat anti rabies FITC, f.
Biakan sel lestari BHK21 C13, g.
Virus rabies CVS -11 ATCC VR 959, h.
Serum rabies standar dari WHO sebelum dipakai diencerkan menjadi 0,5 IUml, i.
Serum rabies standar OIE diencerkan menjadi 0,5 IUml dengan air deionised atau air suling,
j. Serum negatif rabies,
k. Bahanmedia penyimpanan sampel
Prosedur uji:
a. Sediakan sedikitnya 2 lempeng mikro microplate, masing-masing lempeng mikro dibuat
pola sedemikian rupa sehingga lempeng mikro 1 berperan sebagai sebagai kontrol dan lempeng mikro 2 atau selebihnya berperang sebagai tempat sera uji,
b. Media DMEM + 10 FCS ditambahkan pada setiap lubang, lempeng mikro kontrol 1 :
lubang pada baris 1 sampai 4 dan sel A9 sampai A12 sebanyak 150 ul; lempeng mikro uji 2, 3 dst : lubang baris 6 dan 12 ditambahkan 200 ul; lubang yang lainnya sebanyak 100 ul,
c. Serum ditambahkan mengikuti pola yang telah ditetapkan pada lempeng mikro, yaitu
sebanyak 50 ul, d.
Kemudian serum diencerkan sebagai berikut: dengan menggunakan pipet mikro multi campuran media dan serum enceran pertama dihomogenkan dengan cara mengocoknya
minimal 8 kali sucking in and out, kemudian pindahkan sebanyak 50 ul ke lubang berikutnya, begitu selanjutnya sampai pada tabung terakhir. Pada tabung terakhir
sebanyak 50 ul enceran media dan serum dibuang,
e. Kemudian tambahkan pada setiap lubang pada plat uji sera plat 2, 3 dst dengan 50 ul
virus yang telah diukur mengandung 100TCID50ml, f.
Lempeng mikro kemudian ditempatkan inkubasi pada inkubator suhu 37
o
C dengan kandungan 5 CO2 selama 1 jam,
g. Kemudian tambahkan pada setiap lubang dengan suspensi sel BHK21 berumur 3 hari
sebanyak 50 ul yang mengandung 4X105 selml, h.
Lempeng mikro kemudian ditempatkan inkubasi pada inkubator suhu 37
o
C dengan kandungan 5 CO2 selama 48 jam,
i. Setelah inkubasi selama 48 jam, cairan medium dalam setiap lubang dibuang, lubang pada
lempeng mikro dicuci rinsed 1 kali dengan PBS pH 7,2, dan kemudian dicuci satu kali dengan 80 aseton.
j. Kemudian lubang pada lempeng mikro difiksasi dengan 80 aseton pada suhu kamar
untuk selama 30 menit, dan akhirnya dikeringkan pada suhu kamar sekurang-kurangnya selama 1 jam.
k. Setiap lubang pada plat mikro kemudian ditambahkan 50 ul FITC anti rabies konjugat
enceran optimal memberikan reaksi terbaik, digoyang secara perlahan dan diinkubasikan pada suhu 37
o
C selama 30 menit. Setelah itu kelebihan cairan FITC dibuang dan dicuci rinsed sebanyak 2 kali dengan cairan PBS. Kelebihan cairan PBS kemudian dibuang
dengan cara membalikkan lempeng mikro pada kertas saring yang diletakkan di atas meja bench,
l. Hasil uji diperiksa di bawah Mikroskop Fluorescen,
m. Jika D50 dari serum yang diuji lebih kecil dari D50 serum standar positif yang mengandung
0,50 IUml, maka titer serum uji kurang dari 0,5 IUml; sebaliknya jika D50 dari serum yang diuji lebih besar dari D50 serum standar positif yang mengandung 0,50 IUml, maka titer
serum uji lebih besar atau sama dengan 0,5 IUml
Dengan FAVNT, titer serum dinyatakan protektif jika mencapai ≥ 0,5 IUml.
4.3.2. Pengujian Sampel Otak Anjing 4.3.2.1. Pengujian Sampel Otak dengan Fluorescent Antibody Technique FAT
Prinsip : Prinsip dari uji ini adalah terbentuknya ikatan antara antigen virus rabies dengan spesifik
antibodi virus rabies yang telah dikonjugasi dengan zat fluorescen sehingga tampak agregat yang
Kategori