14 dan dicuci kembali dengan air steril sebanyak 3-5 kali. Biji dikeringkan dengan
tissue steril dan ditanam dalam zeolit. Untuk merangsang perkecambahan biji, permukaan wadah ditutup dengan aluminium foil selama 1 malam.
3.3.4 Inokulasi Aspergillus dan Penicillium pada Akar Tanaman Uji,
Pemberian Hara dan Pemeliharaan
Sebelum kecambah diinokulasi, kecambah diamati status endosimbionnya. Bila ditemukan, maka endosimbion diisolasi dengan media yang sesuai dan
dimurnikan pada akhir perlakuan. Kecambah Z. mays yang telah berumur 1 minggu dan 3 minggu untuk S. selanica diinokulasi dengan kurang lebih 3 gram
inokulan kapang. Zeolit steril lembab 200g dimasukkan ke dalam gelas plastik sebanyak kurang lebih sepertiga wadah. Ke dalam wadah kemudian diletakkan
inokulan dan diaduk supaya inokulan tidak menumpuk pada satu daerah saja. Kecambah dimasukkan ke dalam wadah, lalu ditutup dengan sisa media. Larutan
Hoagland digunakan sebagai sumber hara tanaman dengan TCP sebagai sumber P. Tanaman dipelihara selama delapan minggu dan disiram dengan air steril sekali
dua hari atau sesuai kebutuhan.
3.3.5 Analisis Simbiosis Aspergillus dan Penicillium dengan Akar Z. mays dan
S. selanica
Bentuk simbiosis Aspergillus dan Penicillium pelarut fosfat dengan tanaman uji dianalisis melalui beberapa tahap, yaitu analisis kolonisasi Aspergillus dan
Penicillium terpilih pada akar tanaman uji, respon tumbuh tanaman uji yang diinokulasi Aspergillus dan Penicillium pelarut fosfat dengan perlakuan berbagai
taraf TCP dinyatakan sebagai mg P
2
O
5
tanaman dalam larutan Hoagland dan serapan hara tanaman.
15
A Analisis kolonisasi dengan biru tripan 0.05 dan mikroskop pemindai
elektron
Analisis kolonisasi dilakukan dengan cara mewarnai akar tanaman yang telah diinokulasi dengan Aspergillus dan Penicillium menggunakan biru tripan
0.05. Analisis dilakukan terhadap lima contoh dari masing-masing tanaman setiap minggu dengan pemberian dosis P 100 setara 60 mg P
2
O
5
tanaman. Metode pewarnaan akar mengikuti prosedur Kormanick McGraw 1982 dan
diperkuat dengan pengamatan mikroskop pemindai elektron. Akar tanaman dipisahkan dari media dengan hati-hati agar sistem perakaran tidak rusak. Akar
dicuci dengan air mengalir selama 10 menit untuk menghilangkan sisa media tanam dan setelah itu dipotong dengan ukuran 1 cm. Akar direndam dalam larutan
KOH 10 pada suhu 90
o
Pengamatan kolonisasi Aspergillus dan Penicillium pada akar tanaman menggunakan mikroskop pemindai elektron sesuai dengan metode Lewinson
Lewinson et al. 1994. Preparasi diawali dengan merendam sampel akar di dalam caccodylate buffer selama 2 jam, kemudian diagitasi dalam ultrasonic cleaner
selama 5 menit. Akar direndam dalam larutan glutaraldehyde 2.3 selama 2 hari dan difiksasi dengan tannic acid 2 selama 6 jam. Akar dicuci 4 kali dengan
caccodylate buffer selama 5 menit, selanjutnya didehidrasi secara bertahap dalam alkohol 50 5 menit, alkohol 70 20 menit, alkohol 85 20 menit, alkohol
95 20 menit dan 2 kali dalam alkohol absolut 10 menit. Akar selanjutnya direndam dua kali dalam tert butanol selama 10 menit, dibekukan dalam freezer
dan terakhir dimasukan ke dalam freezed drier sampai kering. Akar yang sudah kering diletakkan di atas batang besi dan dilapisi dengan 30 nm emas
menggunakan mesin ion coater IB2. Struktur cendawan yang terdapat pada C selama 10-15 menit untuk menghilangkan isi sel.
Apabila selama proses tersebut akar masih gelap, maka perendaman dapat diperpanjang sampai diperoleh akar yang transparan. KOH dibuang dan sisanya
dihilangkan dengan membilas akar dengan akuades sebanyak 3-5 kali. Akar direndam dalam larutan HCL 1N selama 1 malam, selanjutnya diwarnai dengan
pewarna biru tripan 0.05 selama 20-30 menit. Akar yang telah diwarnai disimpan dalam larutan gliserol 50 dan diamati menggunakan mikroskop
cahaya.
16 permukaan akar diamati menggunakan mikroskop pemindai elektron model JSM
5000 LV yang dioperasikan pada tegangan 20 kv. Pengamatan proses kolonisasi menggunakan mikroskop pemindai elektron dilakukan di Laboratorium Zoologi,
LIPI Cibinong. Akar dinyatakan terkolonisasi bila minimal setengah dari panjang potongan
akar membawa Aspergillus dan Penicillium. Kolonisasi dinyatakan dalam persen jumlah akar terkolonisasi dari seluruh akar yang diamati tiap sampel. Struktur-
struktur khusus cendawan yang terbentuk semuanya diamati dan didokumentasikan menggunakan kamera digital.
B Analisis respon tumbuh dan serapan hara tanaman inang yang
diinokulasi kapang pelarut fosfat
Respon tumbuh dan serapan hara tanaman terhadap inokulasi Aspergillus dan Penicillium pelarut fosfat diuji dengan memberi perlakuan berbagai dosis
TCP dinyatakan sebagai mg P
2
O
5
dalam larutan Hoagland pada tanaman Z. mays dan S. selanica. Dosis TCP yang digunakan yaitu, 0 0 mg
P
2
O
5
tanaman, 50 setara 30 mg P
2
O
5
tanaman dan 100 setara 60 mg P
2
O
5
tanaman. Tanaman kontrol diberi perlakuan 60 mg P
2
O
5
Setelah pengukuran parameter respon tumbuh tanaman selesai, maka dilakukan analisis serapan hara NPK terhadap tanaman tersebut. Analisis NPK
dilakukan di Balai Penelitian Tanah, Bogor secara komposit. Serapan NPK mg haratanaman dihitung dengan mengalikan persentase kadar hara dan bobot
kering masing-masing tanaman. tanaman tetapi
tidak diinokulasi dengan Aspergillus dan Penicillium pelarut fosfat. Parameter respon tumbuh yang diamati yaitu pertambahan tinggi tajuk tanaman, bobot basah
dan kering tanaman, panjang akar serta bobot basah akar.
Sebelum dilakukan analisis NPK, sampel tanaman dicuci dengan air bebas ion untuk menghilangkan debu-debu dan kotoran yang menempel. Contoh
tanaman kemudian dikeringkan di dalam oven dengan suhu 70
o
C. Contoh yang telah kering digiling dengan mesin grinder yang memiliki filter dengan kehalusan
0.5 mm, selanjutnya dipanaskan pada suhu 105
o
C selama 4 jam untuk menghilangkan air dan siap untuk dianalisis.
17 Analisis kadar N dilakukan menggunakan metode Kjehdahl. Sebanyak 0.25
g contoh tanaman dimasukkan ke dalam tabung digestion dan ditambah dengan 1 g campuran selen siap pakai dan 2.5 ml H
2
SO
4
. Campuran diratakan dan dibiarkan selama satu malam. Blanko dibuat dengan cara yang sama tetapi tidak
mengandung sampel. Sampel selanjutnya dipanaskan hingga suhu 350
o
C dan dihentikan setelah terlihat ada uap putih yang keluar sehingga didapat ekstrak
jernih. Tabung diangkat dan didinginkan, kemudian ekstrak diencerkan dengan air bebas ion hingga tepat 50 ml. Ekstrak dikocok sampai homogen dan dibiarkan
semalam agar partikel mengendap. Satu ml ekstrak contoh dipipet ke dalam tabung reaksi, ditambah dengan 9 ml air bebas ion dan divorteks. Dua ml ekstrak
encer dimasukkan dalam tabung reaksi baru dan ditambah larutan sangga Tartrat dan Na-fenat masing-masing sebanyak 4 ml, lalu divorteks dan dibiarkan 10
menit. Masing-masing tabung ditambah 4 ml NaOCl 5, divorteks dan diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 636 nm. Larutan NH4
2
SO
4
Penetapan unsur P dan K dilakukan dengan metode pengabuan basah menggunakan campuran asam nitrat HNO
dengan konsentrasi 0-20 ppm digunakan sebagai standar.
3
dan asam perklorat HClO
4
. Sebanyak 0.5 g sampel tanaman dimasukkan ke dalam tabung digestion, lalu
ditambah dengan 5 ml HNO3 dan HClO
4
dan dibiarkan selama satu malam. Sampel dipanaskan dalam digestion blok pada suhu 100
o
C selama satu jam, kemudian suhu ditingkatkan menjadi 150
o
C. Setelah uap kuning habis, suhu digestion blok ditingkatkan menjadi 200
o
Pengukuran kadar P dilakukan dengan mengencerkan masing-masing ekstrak contoh sampai 10x. Sebanyak 2 ml ekstrak encer contoh ditambah dengan
10 ml pereaksi pewarna P dan divorteks sampai homogen lalu dibiarkan selama 30 menit. Kadar P diukur pada panjang gelombang 693 nm dengan
spektrofotometer UV-VIS. Sebagai standar digunakan larutan PO C. Proses destruksi dihentikan setelah
terlihat ada asap putih yang keluar dan sisa ekstrak kurang lebih 0,5 ml. Tabung diangkat dan dibiarkan dingin. Ekstrak diencerkan dengan air bebas ion hingga
tepat 50 ml dan dikocok sampai homogen dan siap digunakan untuk penentuan kadar P dan K.
4
dengan konsentrasi 0-20 ppm.
18 Pengukuran kadar K dilakukan dengan cara memipet masing-masing 1 ml
ekstrak ke dalam tabung reaksi dan ditambah dengan 9 ml larutan La 0,25 . Larutan divorteks sampai homogen dan kadar K diukur menggunakan
flamefotometer. Larutan standar K yang digunakan adalah K
2
SO
4
Percobaan dilakukan menggunakan rancangan acak lengkap RAL dengan 5 ulangan. Data selanjutnya diolah menggunakan program SPSS 16.0 dan diuji
lanjut menggunakan uji Jarak Berganda Duncan. dengan
konsentrasi 0-250 ppm. Larutan pereaksi yang digunakan dalam penentuan kadar NPK dan rumus yang dipakai dapat dilihat pada Lampiran 3.
3.3.6 Uji Viabilitas Endosimbion
