35 tetap dengan low-pressure gradient system untuk memperoleh komposisi fase
gerak yang konstan selama analisis sistem elusi isokratik. Setelah alat KCKT dihidupkan, maka pompa dijalankan dan fase gerak
dibiarkan mengalir selama ± 30 menit sampai diperoleh garis alas yang datar pertanda sistem kromatografi telah stabil.
3.4.2.2 Penentuan Kondisi Kromatografi untuk Mendapatkan Hasil Analisis yang Optimum
Panjang gelombang analisis ditentukan dengan cara membuat spektrum serapan dari akrilamida baku menggunakan spektrofotometer UV. Kondisi
kromatografi lainnya yang divariasikan untuk mendapatkan hasil analisis optimum adalah komposisi fase gerak dan laju alir. Perbandingan fase gerak yakni
metanol dan larutan asam fosfat 3,5 mM divariasikan 5:95, 10:90, 15:85, 20:80, 25:75 dan 30:70, sedangkan laju alir divariasikan mulai dari 1,2 hingga 1,8
mlmenit. Kondisi kromatografi yang memberi hasil analisis yang optimum lalu ditentukan berdasarkan analisis hasil yang diperoleh. Data hasil optimasi dapat
dilihat pada Lampiran 3 dan 4
3.4.2.3 Analisis Kualitatif
Analisis kualitatif akrilamida dapat dilakukan dengan membandingkan waktu tambat yang sama identik dari kromatogram pada penyuntikan larutan
sampel dengan kromatogram pada penyuntikan larutan baku pembanding akrilamida pada kondisi KCKT yang sama. Untuk mempertegas identifikasi ini,
sedikit larutan baku pembanding akrilamida lalu ditambahkan spiking ke dalam larutan sampel, lalu dianalisis kembali dengan KCKT. Puncak dengan waktu
Limiyanto Tanseri : Pengaruh Suhu Terhadap Kadar Akrilamida Dalam Kentang Goreng Simulasi Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Balik, 2010.
36 tambat yang sama diamati kembali dan dibandingkan antara kromatogram hasil
spiking dengan kromatogram larutan sampel sebelum spiking. Sampel dinyatakan mengandung akrilamida jika terjadi peningkatan tinggi dan luas puncak pada
kromatogram hasil spiking dengan waktu tambat yang sama seperti pada kromatogram penyuntikan larutan baku pembanding.
3.4.2.4 Analisis Kuantitatif 3.4.2.4.1 Penentuan Linieritas Kurva Kalibrasi Baku Pembanding
Akrilamida
Larutan induk baku pembanding ketiga dipipet 1 ml, 2 ml, 2,5 ml, 5 ml, 7,5 ml dan 10 ml; masing-masing dimasukkan ke dalam labu tentukur 25 ml, lalu
diencerkan dengan pelarut sampai garis tanda. Konsentrasi masing-masing larutan adalah 0,4 ppm, 0,8 ppm, 1 ppm, 2 ppm, 3 ppm dan 4 ppm. Masing-masing
larutan disaring melalui penyaring membran Cellulose Nitrate 0,2 m dan
diawaudarakan selama ±20 menit. Setelah itu, filtrat larutan baku pembanding disuntikkan sebanyak 100 l ke dalam sistem KCKT melalui injektor dengan loop
20 l. Direkam kromatogram dan dibuat kurva kalibrasi, lalu dihitung persamaan regresi dan koefisien korelasi. Kromatogram dan data perhitungan dapat dilihat
pada Lampiran 5 dan 6
3.4.2.4.2 Penetapan Kadar Akrilamida dalam Sampel
Larutan sampel yang telah disiapkan seperti pada bagian 3.4.1.6, dimasukkan ke dalam labu tentukur 25 ml dan ditambahkan dengan pelarut
sampai garis tanda. Larutan lalu disaring melalui penyaring membran Cellulose Nitrate 0,2 m dan diawaudarakan selama ±20 menit. Kemudian disuntikkan
Limiyanto Tanseri : Pengaruh Suhu Terhadap Kadar Akrilamida Dalam Kentang Goreng Simulasi Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Balik, 2010.
37 sebanyak 100 l ke dalam sistem KCKT melalui injektor dengan loop 20 l,
menggunakan sistem elusi isokratik dengan fase gerak larutan asam fosfat 3,5 mM dan metanol di mana perbandingan komposisi dan laju alir sesuai dengan hasil
optimasi. Deteksi menggunakan detektor UV pada panjang gelombang hasil optimasi. Direkam kromatogram dan dicatat luas puncak. Kromatogram dapat
dilihat pada Lampiran 7, 9, 11, 13 dan 15 Kadar akrilamida yang terdapat dalam larutan sampel X dihitung dengan
mensubstitusikan luas puncak ke dalam persamaan regresi yang diperoleh dari kurva kalibrasi pada bagian 3.4.2.4.1 sebagai Y. Hasilnya lalu dikali volume
larutan sampel 25 ml, kemudian dibagi dengan berat penimbangan sampel kentang goreng sehingga diperoleh kadar akrilamida dengan satuan
µ gg sampel.
Rumus perhitungan kadar akrilamida dalam sampel dituliskan sebagai berikut.
sampel n
penimbanga berat
sampel larutan
Volume X
sampel dalam
Akrilamida Kadar
× =
Contoh perhitungan untuk mencari kadar dapat dilihat pada Lampiran 22
3.4.2.5 Analisis Data Penetapan Kadar Secara Statistik
Data perhitungan kadar akrilamida pada bagian 3.4.2.4.2 dianalisis secara statistik menggunakan uji t.
Rumus yang digunakan untuk menghitung simpangan baku adalah:
1 -
n X
X SD
2
∑ −
= Sedangkan untuk mendapatkan t
hitung
digunakan rumus:
n SD
X X
t
hitung
− =
Limiyanto Tanseri : Pengaruh Suhu Terhadap Kadar Akrilamida Dalam Kentang Goreng Simulasi Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Balik, 2010.
38 Data diterima jika –t
tabel
t
hitung
t
tabel
pada interval kepercayaan 95 dengan nilai α = 0,05.
Keterangan: SD =
standard deviationsimpangan baku X
= kadar akrilamida
X
= kadar rerata akrilamida n
= jumlah perlakuan Untuk menghitung kadar akrilamida dalam sampel secara statistik
digunakan rumus: n
SD t
X Akrilamida
Kadar ×
± =
µ Keterangan:
= kadar akrilamida t
= harga t
tabel
sesuai dengan derajat kepercayaan Data perhitungan penetapan kadar secara statistik dapat dilihat pada Lampiran 8,
10, 12, 14 dan 16
3.4.3 Validasi Metode 3.4.3.1 Akurasi Kecermatan
Akurasi ditentukan dengan menggunakan metode penambahan baku the
method of standard additives, yakni ke dalam sampel kentang goreng ditambahkan akrilamida baku sebanyak 150 dari kadar akrilamida yang
diketahui terdapat dalam sampel, kemudian dianalisis dengan prosedur yang sama seperti pada sampel. Hasil dinyatakan dalam persen perolehan kembali
Limiyanto Tanseri : Pengaruh Suhu Terhadap Kadar Akrilamida Dalam Kentang Goreng Simulasi Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Balik, 2010.
