2.10. Kerangka Konsepsional
Faktor genetik
Mukosa Nasofaring
Lingkungan EBV
LMP 1
COX-2
VEGF
Metastase Karsioma Karsinoma
Nasofaring Nasofaring
Displasia
Suppression of Apoptosis
Yayan Andrianto : Peranan pemeriksaan imunohistokimia cox-2 Pada karsinoma nasofaring, 2008. USU Repository©2008
BAB 3 Metodologi Penelitian
3.1. Tempat dan Waktu Penelitian 3.1.1. Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di laboratorium patologi anatomi fakultas kedokteran USU dan praktek swasta di Medan.
3.1.2. Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan selama bulan Juli 2007 hingga juli 2008 yang meliputi studi kepustakaan, pengumpulan data, pengumpulan sampel, penelitian dan
penulisan.
3.2. Rancangan Penelitian
Penelitian ini menggunakan rancangan observasional dengan pendekatan cross-sectional
, dimana pada tiap kasus tidak diberi perlakuan, namun hanya melihat hasil pulasan tampilan imunohistokimia Cox-2. Pengukuran
variabelnya dilakukan hanya satu kali dan pada saat itu.
3.3. Populasi, Sampel dan Besar Sampel Penelitian 3.3.1. Populasi
Populasi penelitian mencakup sediaan blok parafin yang telah didiagnosa sebagai karsinoma nasofaring berdasarkan klasifikasi WHO pada
Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran USU dan praktek swasta di Medan.
3.3.2. Sampel
Sampel dalam penelitian ini adalah sediaan blok parafin dari biopsi nasofaring yang diperoleh sejak Juli 2007 - Juli 2008.
Yayan Andrianto : Peranan pemeriksaan imunohistokimia cox-2 Pada karsinoma nasofaring, 2008. USU Repository©2008
3.3.3. Besar Sampel
Besar sampel yang diperkirakan pada penelitian ini dihitung dengan menggunakan rumus :
n = z.d
2
.p 1-p d
2
Keterangan : • n = jumlah populasi
• z = tingkat kepercayaan 95 Æ z-score = 1,96 • p = proporsi seluruh lesi, bila tidak ada dianggap 50 atau 0,5
• d = ketepatan 0,5
Hasil perhitungan : n = 1,96 x 0,5
2
x 0,5 0,5
2
= 42,6 Maka jumlah sampel yang dibutuhkan adalah 43 sampel
3.4. Kriteria Inklusi dan Eksklusi 3.4.1. Kriteria Inklusi
Karsinoma nasofaring dan displasia
3.4.2. Kriteria Eksklusi
• Sediaan tidak adequat hanya mengandung darah • Sediaan tidak dapat didiagnosa
• Sediaan hanya sedikit sekali • Limfoma
• Hemangioma
Yayan Andrianto : Peranan pemeriksaan imunohistokimia cox-2 Pada karsinoma nasofaring, 2008. USU Repository©2008
3.5. Defenisi Operasional Variabel
- Karsinoma Nasofaring
Merupakan suatu karsinoma yang timbul dari mukosa yang ditunjukkan pada perubahan skuamous.
- Karsinoma Sel
Skuamous Merupakan neoplasma ganas yang berasal dari pelapis epitel mukosa
kavum nasal atau sinus paranasal yang terdiri dari tipe keratinisasi dan non –keratinisasi.
- Karsinoma Sel Skuamous Berkeratin
Adalah karsinoma invasif yang menunjukkan diferensiasi skuamous yang jelas pada pemeriksaan mikroskopis baik bentuk
intercellular bridge
atau berkeratin yang banyak pada tumor.
- Karsinoma Sel Skuamous yang tidak Berkeratin
Tumor ganas yang berbentuk solid dan irreguler.Yang terdiri dari berdiferensiasi dan tidak berdiferensiasi.
- Karsinoma Lymphoepithelial atau Karsinoma yang tidak Berdiferensiasi
Merupakan suatu karsinoma sel skuamous yang berdiferensiasi buruk yang disertai dengan infiltrasi limfoplasmasitik reaksi yang menonjol dan
morfologi sama untuk karsinoma nasofaring.
Yayan Andrianto : Peranan pemeriksaan imunohistokimia cox-2 Pada karsinoma nasofaring, 2008. USU Repository©2008
3.6. Prosedur Penelitian 3.6.1. Pembuatan Sediaan Mikroskopis
Sediaan mikroskopis dibuat dengan cara sebagai berikut : 1. Blok parafin yang telah dikumpulkan, disimpan dalam freezer sampai
cukup dingin, selanjutnya dipotong tipis dengan menggunakan mikrotom dengan tebal 4
μm. Setiap blok parafin, dipotong sebanyak 2 kali, masing-masing untuk pulasan HE dan pulasan imunohistokimia Cox-2.
2. Sampel blok paraffin yang sudah dipotong tipis 4 μm, selanjutnya
ditempelkan pada objek gelas. 3. Untuk pulasan immunohistokimia Cox-2, digunakan kaca objek yang
telah di coating agar jaringan dapat menempel pada kaca objek selama proses pulasan imunohistokimia.
Proses pembuatan coating kaca objek gelas adalah sebagai berikut : 1. Kaca objek direndam seluruhnya dalam aseton selama 10 menit
2. Masukkan dalam larutan APES 3-Aminopropyltriethoxysilene, Cat No.a 3548 sigma 5 ml + Aseton 195 ml selama 10 menit.
3. Kaca objek selanjutnya dicuci dengan akuades 4. Keringkan dalam inkubator dengan suhu 37
°C selama semalaman 5. Kaca objek siap digunakan.
Cara menempelkan potongan tipis pada kaca objek adalah menggunakan ujung pisau atau pinset yang runcing, potongan - potongan tipis dipisahkan
dan diratakan dengan memasukkan potongan tersebut dalam air hangat, setelah mengembang pindahkan ke objek gelas. Selanjutnya, kaca objek
yang mengandung potongan jaringan diletakkan diatas alat pemanas hot
plate atau dimasukkan dalam air panas
floating bath
dengan temperatur 50-60
°C. Setelah parafin melunak karena panas, potongan jaringan diletakkan dalam kaca objek kembali dan dikeringkan dengan cara
Yayan Andrianto : Peranan pemeriksaan imunohistokimia cox-2 Pada karsinoma nasofaring, 2008. USU Repository©2008
menyandarkan pada alat pemanasan. Setelah kering, potongan jaringan siap untuk dipulas.
3.6.2. Prosedur Pulasan Imunohistokimia anti Cox-2
1. Siapkan preparat berupa potongan tipis jaringan 4 μm yang sudah
ditempelkan pada objek gelas yang telah dicoating 2. Preparat yang siap dipulas dimasukkan dalam inkubator 1 malam
dengan suhu 38 °c
3. Deparafinisasi dengan mencelupkan preparat ke dalam cairan Xylol sebanyak 3 kali, masing-masing selama 5 menit
4. Rehidrasi dengan cara mencelupkan secara berurutan dalam Etanol 98 sebanyak 3 kali, masing-masing selama 5 menit, Alkohol 90, 80 dan
70, masing-masing selama 5 menit 5. Bilas dengan air mengalir selama 5 menit
6. Masukkan ke dalam H
2
O
2
0,3 dalam metanol dingin selama 15 menit 7. Bilas dengan akuades selama 5 menit
8. Masukkan ke dalam larutan Buffer Sitrat yang telah dipanaskan sebelumnya dalam microwave selama 5 menit dan kemudian sebanyak
2 kali selama 5 menit 9. Dinginkan selama 20 menit dalam suhu ruangan
10. Bilas dengan akuades selama 5 menit dan keringkan air di sekitar potongan jaringan
11. Tandai disekeliling potongan jaringan yang ingin dipulas dengan pap pen 12. Bilas dalam larutan PBS selama 5 menit
13. Bersihkan dari sisa cairan pencuci 14. Teteskan blocking serum pada sediaan yang telah ditandai dengan pap
pen selama 5 menit 15. Bilas dalam larutan PBS selama 5 menit
16. Bersihkan dari sisa cairan pencuci 17. Teteskan antibodi primer anti
Cox -2 dengan pengenceran 1:50, inkubasi
dalam tempat tertutup dengan suhu ruangan selama 60 menit
Yayan Andrianto : Peranan pemeriksaan imunohistokimia cox-2 Pada karsinoma nasofaring, 2008. USU Repository©2008
18. Bilas dalam larutan PBS sebanyak 2 kali, masing-masing selama 5 menit 19. Bersihkan dari sisa cairan pencuci
20. Teteskan dengan antibodi sekunder, biotinylated universal, inkubasi
dalam tempat tertutup dengan suhu ruangan selama 10 menit 21. Bilas dalam larutan PBS sebanyak 2 kali, masing-masing selama 5 menit
22. Bersihkan dari sisa cairan pencuci 23.
Teteskan dengan streptavidin-peroxidase conjugate, inkubasi dalam tempat tertutup pada suhu ruangan selama 10 menit
24. Bilas dalam larutan PBS sebanyak 2 kali, masing-masing selama 5 menit 25. Bersihkan dari sisa cairan pencuci
26. Teteskan larutan kromogen dab selama 5-10 menit 27. Bilas dengan air mengalir
28. Counterstain dengan hematoksilin mayer selama 2 menit 29. Bilas dengan air mengalir
30. Dehidrasi dengan cara mencelupkan secara berurutan pada cairan
alkohol 70, 80, 90 dan etanol 98 masing-masing 20 celupan 31. Masukkan dalam cairan xylol selama 3 menit
32. Teteskan entelan dan tutup dengan kaca penutup.
3.7. Alat dan Bahan Penelitian 3.7.1. Alat-alat Penelitian
Alat-alat yang dibutuhkan untuk penelitian ini adalah : mikrotom, waterbath, hotplate, freezer, inkubator, staining jar, rak objek glass, rak
inkubasi, pensil diamond, pipet mikro, timbangan bahan kimia, kertas saring, pengukur waktu, gelas erlenmeyer, gelas beker, tabungan
sentrifuge 15 ml, microwave, spin master, thermolyte stirrer, gelas objek, kaca penutup, entelan dan mikroskop cahaya.
3.7.2. Bahan Penelitian
Pulasan imunohistokimia menggunakan metode Labelled Streptavidin
Biotin Immunoperoxidase Complex
, menggunakan Novostain Universal
Detection Kit NCL
- RTU
- D
Novocastra, Inggris. Antibodi primer
Yayan Andrianto : Peranan pemeriksaan imunohistokimia cox-2 Pada karsinoma nasofaring, 2008. USU Repository©2008
yang digunakan adalah Lyphilisised
Monoclonal Antibody
NCL -
COX -2,
Clone 4H12 Novocastra, Inggris, dengan pengenceran 1:50. Novocastra Universal Detection Kit NCL-RTU-D terdiri dari :
1. 1 botol Blocking serum 2. 1 botol Biotinyllated Universal Secondary Antibody
3. 1 botol Streptavidin-Peroxidase Conjugate Larutan kromogen dab yang digunakan adalah liquid dab substrate kit ncl-l-
dab novocastra, inggris : 3,3’- diaminobenzidine. Larutan PBS Phosphate Buffered Saline pH 7,2 ; terdiri dari :
• Na
2
HPO
4
1,92 g • Na
2
H
2
PO
4
H
2
O 1,92 g • NaCl 5,90 g
• Dalam Akuades 1,0 l
Larutan Buffer Sitrat Sodium Citrate Buffer pH 6,0 terdiri dari : • 1,92 g citric acid dalam akuades 1 L
• 0,5 ml tween 20 counterstain dengan menggunakan hematoksilin
mayer.
3.8. Instrumen Penelitian
Instrumen penelitian yang digunakan adalah hasil pulasan imunohistokimia Cox
-2 terhadap sampel sediaan jaringan biopsi nasofaring. Untuk penilaian terhadap pulasan imunohistokimia Cox-2 adalah sebagai berikut :
• Kontrol positif : karsinoma nasofaring yang telah diketahui positif • Kontrol negatif : karsinoma nasofaring dengan antibodi primer yang
digantikan dengan serum normal • Positif : pada sitoplasma sel berupa warna coklat.
Imunoekspresi dihitung secara semikuantitatif sebagai berikut : • Skor 0 : negatif bila sel tidak terwarnai
Yayan Andrianto : Peranan pemeriksaan imunohistokimia cox-2 Pada karsinoma nasofaring, 2008. USU Repository©2008
• Skor +1 : 10 sel yang terpulas fokal • Skor +2 : 10-49 sel yang terpulas fokal
• Skor +3 : 50 sel yang terpulas difus
Sel-sel tumor dengan skor 0 dan +1 dinilai sebagai tampilan lemah sedangkan dengan skor +2 - +3 di nilai sebagai tampilan kuat.
Penilaian terhadap pembuluh darah dari karsinoma nasofaring: Density pembuluh darah :
Skor 1: sedikit Skor 2: banyak
3.9. Teknik Analisa Data